3D打印多孔矿化胶原-硫酸钙仿生组织工程骨修复兔股骨髁包容性骨缺损的实验研究

•论著•文章编号：1009-4237(2020)06-0408-06 3D打印多孔矿化胶原-硫酸钙仿生组织工程骨
修复兔股骨課包容性骨缺损的实验研究
刘建恒，李明，刘鐘阳，孙国飞，刘真，崔翔
【摘要】目的探讨3D打印多孔矿化胶原-硫酸钙仿生组织工程骨(3D printing cclcium sulfate hemihy­drate/m ineralized collagen,3D-CSH/nHAC)对包容性骨缺损的修复能力和成骨效果。

方法水热法制备半水
硫酸钙;传统模具方法制备矿化胶原-硫酸钙仿生组织工程骨(CSH/nHAC);采用3D技术制备新型组织工程
骨(3D-CSH/nHAC)，扫描电镜观察人工骨表面微观形态。

选取新西兰白兔18只(由解放军总医院动物中
心提供)，雄性10只，雌性8只，兔龄15-18个月，体重2.5~3.Okg。

随机分为三组，每组6只:A组,空白对
照组;B组,CSH/nHAC组;C组,3D-CSH/nHAC组。

制作临界性股骨課骨缺损模型,分别植入相应修复材
料。

术后4(8(12周分批处死动物，通过大体观察、X线(Micro-CT及组织学观察骨缺损处修复效果。

结果
扫描电镜示传统组织工程骨为棒状硫酸钙与不规则颗粒状矿化胶原的镶嵌复合结构;3D-CSH/nHAC具有
多孔结构,大孔结构完整，孔隙之间壁较薄，孔孔之间相互交通。

术后4(8(12周X线检查可见C组的骨密
度高于其他两组，骨缺损修复较好;术后4(8(12周Micro-CT检查可见C组骨缺损处有较多新生骨组织生
成，修复明显好于其他两组。

术后组织学检查:C组术后1个月可见小片状类骨质出现，植入材料开始降解，
术后3个月时新生骨呈现片状结构,3D-CSH/nHAC几乎完全降解，骨缺损处成骨量明显优于B组和C组。

结论临界性包容性骨缺损不能自我修复，可作为研究骨缺损的模型;3D-CSH/nHAC骨组织工程修复材料
修复骨缺损能力优于传统组织工程材料,是一种有前景的骨缺损修复材料。

$关键词】3D打印；骨缺损；骨修复；硫酸钙骨水泥；矿化胶原；模型
$中图分类号】R683.42$文献标识码】A$DOI】10.3969j.issn.1009-4237.2020.06.002
Experimental study on a new tissue engineering bone
in repairing rabbst bone defect
LIU Jian-heng1,LI Ming',LIU Zhong-yang1,SUN Guo-fei,LIU Zhen1,CUI Xiang'
(1.Department of Othopaedics,the First Medicci Centeo of PLA Generai Hospital,Beijing100853,China；
2.Beijing Southern Medicci District of PLA Generai Hospital,Beijing100073,China)
)Abstract]Objective To investicate the ability of Calcium sulfate hemihydrate and Calcium sulfate hemi-hydrate/mineralized ccllagen(calcium sulfate hemihydrate/mineralized ccllagen,CSH/nHAC)in repairing bone re­
pair6琏(31.MetUods Calcium sulfate hemihydrate was prepared by hydrothermal method.The novei tissue engi­
neering bone was prepared and scanning electron microscopy was used te observe the microstructure of new artificigi
bone surface.Eighteen New Zealand white rabbits were divided inte three groups with6in each group:group A,con-
trol group；group B,CSH group；group C,CSH/nHAC.There were10males and8females,aaed from15te18
months and weighing from2te3.0kg.Critical bone femoraf condylc defect was made in this experiment.Then at
the rabbits were implanted in bone repair materials,respectively.At4,8,12weeks aftea suraery,the rabbits were
kiled in batch,and the samples were harvested and detected by X-rays,Micro CT scan,and histologicai observation.
Results Scanning electron microscopy indicated that the new material was composed of cclcium sulfate and imecu-
lar granulgs mineralized ccllaaen；3D-CSH/nHAC had porous structure and larae holc structure inteerity,the wall
betreen the pore was thin,and the pore was connected with each othea.At4,8,12weeks after suraery,the result of
X-ray indicated that group C repaired good bone defect better than the other two groups;the same result was also ob­
served in the Micro CT exzmination.The result of postoperative histological observation showed that in group C small
基金项目：国家自然科学基金青年项目(81702121；81702153)；军队医学科技青年培育计划孵化项目(19QNP052)；军队后勤科研项目重大项目分课题(AWS17J004)
作者单位：100853北京，中国人民解放军总医院第一医学中心(刘建恒，李明，刘鐘阳,孙国飞，崔翔)；100073北京，中国人民 解放军总医院京南医疗区(刘真)
通信作者：崔翔,E-mail:cuixiang0818@
flake osteoii appeared a month aftco suraee and CSH/nHAC becan te decrade.Three months afteo sugee’CSH/ nHAC almost completety decradated and bone mas s in bone defect area was superior te group A and group elusion The critical bone femoral condyle defect cannot repaii itself and it can be used as a research model of bone defect；the abiey of CSH/nHAC tissue engineering material te repaii bone defect is better than that of pure CSH. CSHjnHACosakond oepeomosongbon7eg7n7eaioon maieoaeon ih7euiue.
)Key words]3D printing；bone defect；bone repaii；calcium sulfate cement；mineralized ccOagen；model
骨组织具有较好的自我修复能力，对于较小的骨缺损常能自我修复。

目前由于骨折、肿瘤切除、慢性感染等原因导致骨缺损日益增加，其中大部分需要进行骨移植术’移植骨的来源主要有自体骨、异体或异种骨及人工骨。

自体骨被誉为骨移植术的金标准［1-2］，但是自体骨移植存在来源有限、供区疼痛、神经损伤及感染等并发症。

同种异体骨来源广泛，已广泛用于临床的骨移植手术，但存在免疫源性及传播疾病危险。

其次同种异体骨需进行处理加工及消毒等过程，促进骨缺损的能力不如自体骨［3-4］'组织工程人工骨为这一临床问题解决提供了新的途径。

！型半水硫酸钙具有良好生物相容性和原位自固化性能,矿化胶原骨修复材料的骨诱导修复能力'本课题在传统方法制备半水硫酸钙和矿化胶原基础上，结合新兴的3D打印技术对其进行加工,制备新型骨组织工程修复材料，验证其在动物体内修复骨缺损的能力,为下一步临床应用提供理论依据。

材料与方法
1材料制备
二水硫酸钙（CaSO。

・2比0）为医药级，购自德国Merk公司，柠檬酸钠和硫酸铝均为分析纯，购自国药集团试剂有限公司。

矿化胶原$nHAC）由清华 大学材料实验室提供。

水热法制备！型半水硫酸钙。

具体如下:称取300g CaSO4-2比0,加入反应釜中，再称取0.75g $CaSO4-2比0含量0.25%&柠檬酸钠和0.75g $CaSO4-2H20含量0.25%）硫酸铝，作为转晶剂加入反应釜中，再加入1701g$CaSO4-2H20含量的5.67），，
400转/min,反应釜内反应温度升高到120i,此时反应釜内压力为120i时水的饱和蒸汽压，约0.198MPa,反应6h。

反应完毕后将反应液趁热倒入一大烧杯,然后进行抽滤。

漏斗内先垫一块120目滤布,滤布上面垫二层滤纸，趁热抽滤。

抽虑完毕后
5次,,作过程都要保证滤液和冲洗液温度在90i以上。

将抽干的滤饼放入干燥箱中100i干燥过夜，即制得！型半水硫酸钙$CaSO4-1/2比0）。

取出CaSO4-1/ 2比0,用研钵研磨,100目塞子过筛,制得粒径均一的！型CaSO4-1/2比0粉末o
传统CSH/nHAC制备:将!型半水硫酸钙与矿化胶原进行混合，其中矿化胶原的比重是10%，体外灌入模具、塑形成柱状，直径5mm，高度10mm。

3D打印CSH/nHAC制备:将!型半水硫酸钙与矿化胶原进行混合，其中矿化胶原的比重是10%。

混合材料在4i条件下打印成多孔三维支架，孔径300"m。

支架定制化外形的控制上，从已的CT据生成型,并进行打印
,7mm,10mm。

扫描电镜观察制备的CSH及CSH/nHAC在扫描电镜$SEM,JEOL,Japan）下观察材料表面情况。

2动物模型制备及其分组
新西兰白兔由解放军总医院动物中心提供，共18只，雄性10只，雌性8只，兔龄15-18个月，体重2.5~3.0kg。

随机分为三组，每组6只。

A组为空白对照组;B组为！半水硫酸钙组$CSH/nHAC）；C 组为新型人工骨组$3D-CSH/nHAC）。

所有手术在医院手进行。

苯巴比妥钠肌肉注射麻醉（25mg/kg）。

将兔仰卧位固定于手术台上,股骨远端备皮，消毒、铺巾。

在外侧股骨課部中点作一纵行3cm长切口,切开皮肤、皮下、深筋膜，注意勿损伤腓总神经,暴露外侧股骨課。

距股骨远端关节面4mm处用通用型电钻与关节面平行由外向内钻孔，制作股骨課包容性骨缺损,直径7mm,深度10mm,破坏一侧皮质，保护对侧皮质。

生理盐水冲洗伤口。

按照分组，分别植入CSH/nHAC、3D-CSH/nHAC,以及留置空白缺损。

常规缝合切口，见图1。

术毕，逐层缝合。

术后给予青霉素80万U/只，肌肉注射，连用3d。

3观测指标
3.1材料SEM分析将制备好的CSH、nHAC、CSH/nHAC以及3D打印复合材料通过导电胶粘到金属台上，镀金，通过JSM-6460LV型扫描电镜观察材料的形貌。

・410
・
创伤外科杂志2020年第22卷第6期 J Tauma S u ： ,2020, Vol. 22, No. 6
7mm
3.2 一般
观察
实验 的存活、切口有无
渗血及愈合、肢活 t
o
3.3 X 线及Mica-C 检查
4( 8( 12 分处
，进行 X 线、Mica-CT
o
量注射 比
组 处死，
股
骨标本，剔除周围软组织，进 行 X 线检杳(Simens , Gena-
ny )° X 立即进行Mica-CT (ZKKS-MCT-Sharp , 广州) 。

3.4组织学评估
4(8(12周取兔股骨課缺
损经4%的多聚甲醛固定,
10%的甲酸脱钙
20 _30d ,然 大 适所要部位的组织标本%
水洗1h %按80%、90%、95%( 100%各种浓度乙
醇2h 脱％二甲苯透明2次%浸蜡包埋%切，沿
股骨的纵轴方向切片,厚5"m , HE 染色、天狼猩
红染色。

光学 镜下观察骨缺损区域骨组织
的长 及。

镜 ，拍
摄骨缺损区域,骨皮质尽量排除。

10倍镜下，每
个标本 5 ，采用 Imaae Pa Plus 5. 1
图像分析 测量,按
计算骨组织的含
量百分比及I 型胶原百分比。

图1手术过程图片。

a.骨缺损制备；b.骨缺损模型；c 、e.填充材料后
4 计学分析
SPSS 17.0统计软件进行分析。

计量资料
以；±<表示,组
立样本方检验。

p <
0.05
异 计学意义。

结果
1半水硫酸钙、矿化胶原以及复 貌
通过水热法合成a 半水硫酸钙，为白色粉末。

图2a 、b a
硫酸钙的大体图片。

图2c 〜d 为
a 半水硫酸钙电镜
，
， 二水
硫酸钙转化
a
硫酸钙，
貌发生
化，由原来的 或
成。

图
2e 〜f 为二水硫酸钙的电镜 ，二水硫酸钙
状
或板状晶体。

图3为CSH/nHAC 和3D-CSH/nHAC 骨组织含量百分比(%)
生骨 _
骨缺损区域
X100%
复合材料扫描电镜结果，CSH/nHAC 为两相结构,
矿化胶原 在CSH 的。

3D-CSH/
#型胶原 _
骨缺损区域
X100%
I 型胶原百分比(%)=
图2 a. a 型半水硫酸钙;
b.a-CSH/nHAC 复
合物固化后；o 、d. a
硫酸钙电镜照
片;e 、f 二水硫酸钙
电镜照片(X20)
nHAC 具有多孔
，大孔结构完整,孔隙之间壁较
薄，孔孔 通。

图3 a.CSH/nHAC复合物固化扫描电镜照片；b.3D-CSH/ nHAC复合物固化后的扫描电镜结果（X20）
2一般情况
实验1h左右苏醒。

两组动物术后均无感染发生,切口无红肿、渗血发生,无窦道形成,切口处无内分泌形成，切口10d右愈合。

3J 组1侧关节活，考虑骨折发生，遂补充1只。

3X线观察
2,B组和C组大部分然可见，骨缺损依然，观察的骨再生。

4 ,B组和C组部分，缺损区域，边缘
部分高信号,C g—些。

8,B组和C组的大部分，部分见余，缺损生骨，大部分骨缺损区域消失，在C组可见一些骨缺损愈合。

12, C组骨缺损区域愈，B组3个标本骨缺损区域愈合，其余标本骨缺损修复。

而对组8骨缺损,12骨缺损区未见的新生骨形成。

见图4a〜a
图412
X线片:a.空白对
照组；b.CSH/
nHAC组；c.3D
CSH/nHACA组。

术后12周Micre-
CT:d.
对组；e.CSH
nHAC组；f.3D
CSH/nHACA组
4Micra-CT观察
Micra-CT的见图4d〜f。

在此次研究中骨缺损模型性股骨課包容性骨缺损,其
存了对侧的皮质。

新生骨主要从骨缺损的周围及残存的骨基质长入。

另外，主骨的，mx cra-CT的重建图像去区分新生骨和宿主骨能,利用Mica-CT测出的一些骨准确。

但是,MX w-CT的建：新生骨从骨缺损的边缘长入。

观察骨缺损的修复情况,本研究Micra-CT的软件对图像进行处理，进种图像，建的大体图像、去一侧皮质图像和去双侧皮质图像。

从图5可见,C组骨缺损修复。

12对组骨缺损依然,无骨成，量皮质骨形成。

5组织学观察
5.1实验分析对照组12周骨缺损未修复，纵见，与骨折端分界清
，组织切见大量组织；
4,B组和C组，在围有生骨形成，观察到骨基质、骨和骨小，部分标本可观察到血。

而A组骨缺损区域被血或组织。

8,B组和C组的骨生成加速，大部分，部分标本可见量。

新生骨的增加，血增加。

而A组缺损区域新生骨。

12丄组和C组新生骨组织增加，，骨缺损区域被骨，镜观察C组的骨
B组。

A组骨缺损见量生骨组织。

骨缺损，部分标本缺损区域被
组织。

图5d〜f为天狼猩红染色。

天狼猩红主要是针对I型胶原的染色，新生骨基1I 型胶原90%,本研究进行了I型胶原染色，镜色或色。

见图5。

5.2组织学定量分析除
镜下观察骨组
织 的再生 ，本研究还进行 量分析。

如图6 ,在HE 染色中，从4〜12 ,对照组新生骨由(6.20 ±7.6 ) %增加到 (15. 40 ± 5. 30 ) % , CSH/nHAC 组由(32. 20 ±
6. 26) % 增加至( 41. 60 ± 4. 39 ) % , 3D-CSH/ nHAC 组由(42.70 ± 3. 96 ) % 增加至(62.80 ±
7. 89) %，与3D-CSH/nHAC 组相比，空白对照组 和CSH/nHAC 组的面积明显少于3D-CSH/nHAC
组，差异
计学意义。

在天然猩红染色中,
本研究计
I 型胶原 骨缺损处 的百
分比， 计算I 型胶原 ，是因为骨基 的 主要为I 型胶原 。

在各 点，与
3D-CSH/nHAC 组
， 对 组和 CSH/
nHAC 组的
3D-CSH/nHAC 组，差
异 计学意义， 3D-CSH/nHAC 组 「
的骨缺损修复能力。

图5 a.术后12周的HE 染色，空白对照组；b. CSH/nHAC 组；c. 3D-CSH/nHACA 组；d.术后12周天狼猩红染色，空白对照组；
e. CSH/nHAC 组；
f. 3D-CSH/nHACA 组
O 空白对照组
盟 CSH/nHAC 组
Q 3D-CSH/nHACA 组
口空白对照组 宓 CSH/nHAC 组
40 _ O 3D-CSH/nHACA 组
20酸钙已经 骨缺损的修复，
原位自固
化性能和较高的力学强
，化的力学 :
达30MP ，高于松质骨的
，但是也存在 L
的缺点，
，在
4〜8启+7,。

全降解后，在骨缺损处形成空白区，纤维组织易长
，进
骨再生+8'10］，发生骨不连，这
水硫酸钙的
一定限制。

本实验
的矿化胶原nHAC 为依据天然骨
外基
计的并且
分级
的仿生骨修复。

胶原
胶原
股 分子自组装形成，以胶原分子为模板，调制
钙磷盐
排列的胶原 组 成。

相
关实验证实， 成分与天然骨，具
8W
12W
时间点(周)
图6 HE 染色和天狼猩红染色的定量分析结果
硫酸钙作为骨缺损的修复 1892年由Dressmann 使用‘PetTove 于1928年使用硫酸钙治 疗狗骨缺损，后来 道+5_6］床 硫酸钙的结
，实硫酸钙
， 大差异，进
成成骨性能 。

目前，美国FDA 已经批准
Osteoset 的医用硫酸钙
床。

本次
实验中，!-CSH 由CSD 经 成，目前 硫
创伤外科杂志2020年第22卷第6期J Trauma Surg,2020,V o U22,No.6-413-
的生物相容性和生物活性，能够诱导细胞黏附与增值[11'12]，但是其不具有可注射性。

为此结合两种材料的优点，本研究制备了CSH/nHAC复合骨修复材料。

CSH/nHAC复合骨修复材料具有良好注射型，同时也有良好的骨诱导和骨传导性能，这在相关研究中已得到证实’Kim等[13]制备了一种3D打印CSH/HAp/PCL骨修复支架，可有效促进成骨前体细胞黏附、增殖与分化。

Qi等[14〕也证明，3D打印的 CSH介孔生物活性玻璃支架可促进bMSCs的粘附、增殖、碱性磷酸酶（ALP）表达活性以及成骨基因表达，并在体内可显著促进颅骨缺损的新骨形成。

理想的生物材料应该具备以下条件：良好的生物相容性，材料具有多孔结构，利于血管和细胞的长入，降解的速度与骨生长速度一致，同时具有骨诱导性和骨传导性等[15]o前期的体外实验研究表明，CSH/nHAC具有良好的生物相容性和骨再生性能，和单纯的CSH相比,其不仅仅是良好的骨替代材料,而且能够在早期加速骨愈合。

参照以前研究，复合材料中的nHAC的含量为10%，液固比为0.6mL/j[16]，本研究以此将CSH/nHAC和3D-CSH/ nHAC植入动物体内，骨缺损模型为兔股骨課骨缺损，结果显示3D-CSH/nHAC的修复骨缺损能力优于传统的3D-CSH/nHAC支架。

本研究也存在一些局限性,包括研究的样本量较小、未使用大动物进行验证。

下一步工作中，本研究将扩大样本量,并在比格犬等大动物模型中进行研究。

综上所述，与传统CSH/nHAC相比，3D-CSH/ nHAC复合骨修复材料具有更好的骨修复性能，是一种良好的骨移植材料，具有I临床应用前景'
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(本文编辑：郭卫)。