吲哚乙酸IAA检测方法及氧化酶活性的测定

吲哚乙酸IAA检测方法及氧化酶活性的测定吲哚乙酸IAA检测方法及氧化酶活性的测定一、原理
1、吲哚乙酸产品概述:
吲哚乙酸可占植物体内吲哚乙酸的50-90%，可能是生长素在植物组织中的一种储藏形式，它们经水解可以产生游离吲哚乙酸。

吲哚乙酸可刺激形成层细胞分裂;吲哚乙酸刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长;促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成。

吲哚乙酸在器官和整株水平上，吲哚乙酸从幼苗到果实成熟都起作用。

吲哚乙酸控制幼苗中胚轴伸长的可逆性红光抑制;当吲哚乙酸转移至枝条下侧即产生枝条的向地性;当吲哚乙酸转移至枝条的背光侧即产生枝条的向光性;吲哚乙酸造成顶端优势;延缓叶片衰老;施于叶片的生长素抑制脱落，而施于离层近轴端的生长素促进脱落;吲哚乙酸促进开花，诱导单性果实的发育，延迟果实成熟。

2、试验原理:
吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。

植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。

酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。

吲哚乙酸的含量可用比色法测定。

二、准备仪器及药品
T6新悦型分光光度计离心机
恒温水浴锅天平
研钵试管
移液管烧杯
20mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0(见附表2)。

1mmol/L2，4—二氯酚:称取二氯酚16.3mg用蒸馏水配制成100ml。

1mmol/L氯化锰:称取MnCl?4HO 19.8mg用蒸馏水配制成100ml。

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1mmol/L吲哚乙酸:称取IAA 17.5mg用少量乙醇溶解，然后将其倒于盛有约
90ml蒸馏水的容量瓶中(100ml)，稀释至刻度。

吲哚乙酸试剂A或B(任备其中之一):
试剂A:15ml 0.5mol/L FeCl3，300ml浓硫酸(比重为1.84)，500ml蒸馏水，使用前混合之即成，避光保存。

用时1ml样品中加入试剂4ml。

试剂B:10ml 0.5mol/L FeCl3,500ml 35%过氯酸，使用前混合之即成，避光保存。

用时于样品中加入试剂。

试剂B较试剂A灵敏。

三、操作步骤
1(将大豆或绿豆种子于30?温箱中萌发3梍4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作材料。

2(取0.5g下胚轴，置研钵中，加入预冷的磷酸缓冲液5ml，置冰浴中研磨成匀浆。

再按100mg鲜重材料加0.5ml磷酸缓冲液的比例，用磷酸缓冲液洗涤研钵。

离心(4000r/min)10分钟，所得上清液即为粗酶液。

3(取试管2支，于一试管中加入氯化锰1ml，二氯酚1ml，IAA2ml，酶液1ml，磷酸缓冲液5ml，混合均匀。

另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。

一起置于30?恒温水浴中，保温30分钟。

IAA(175ug磷酸缓冲液处理 MnCl2 2、4-二氯酶液
/mL) (pH6.0)
酚
实验组 1 1 2 1 5 对照组 1 1 2 0 6
4(吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂B 4ml，摇匀，置于30?的黑暗处保温30分钟，使显色。

5(将显色后呈现红色的反应液于分光光度计中测定吸光度，测定时用波长
530nm。

6(根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量(或从直线方程式计算反应液中吲哚乙酸IAA的残留量)。

7(从开始时加入的吲哚乙酸量减去酶作用后残留的吲哚乙酸量，即得被酶所分解破坏的吲哚乙酸量。

以每ml酶液在1小时内分解破坏吲哚乙酸量(μg)表示酶活力的大小。

8(配制浓度从0梍25μg/ml的IAA溶液，分别测得吸光度A，然后绘制标准曲线，或计算直线回归方程。