iPS细胞制备技术

iPS细胞制备技术
随着对iPS细胞重编程机制研究的不断深入，iPS细胞的制备体系不断完善，目前iPS细胞的制备方法多种多样，但以Yamanaka的“四因子”诱导体系较为经典，本书在此简要阐述此制备方法。

一、小鼠iPS细胞制备
【实验步骤】
1.建立小鼠胎儿成纤维细胞系
（1）脱颈处死13.5天孕鼠，分离出子宫并用PBS浸洗。

（2）用手术镊将胚胎从胎盘和周围膜系组织分离开，去除头、性腺和内脏组织。

（3）将胚胎转移至一个新100mm皿进行PBS清洗，剪刀剪碎组织，放于含有0.1%胰酶/0.1mmol/L EDTA溶液的50ml离心管，于37℃消化20分钟，重新加酶，再次消化。

（4）加入等体积FP溶液（含10%FBS，50U&50mg/ml青霉素和链霉素的DMEM）中止消化，吹打数次以帮助组织破碎。

（5）室温（20～25℃）放置5分钟以沉降大块组织，取上悬液体于离心管进行离心，1200r/min×5min，弃上悬液并用新鲜液体重悬。

（6）计数细胞，并调节细胞浓度至1×106/ml。

一般约1×107
细胞/胚胎，1×107细胞/100mm皿于37℃，5%CO2培养24小时。

（7）次日，PBS清洗去除未贴壁细胞，待细胞铺满皿底，换掉FP液，用PBS清洗一次，1ml 0.05%胰酶/0.53mmol/L EDTA消化5分钟，加入9ml FP液并吹打成细胞悬液，传代按1∶4进行（用于iPS 诱导的MEFs代次最好选用3代以内）。

2.饲养层细胞准备
（1）复苏 SNL 细胞
1）由液氮罐中取出SNL冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，并晃动冻存管直到融化。

2）乙醇擦拭冻存管盖及冻存管壁，将管内冻存悬液转移入预先准备的SNL液体中，800r/min×5min，弃去上液。

3）重新加入10ml SNL液体重悬细胞，转入明胶铺被的100mm皿中，于37℃，5%CO2培养至细胞80%～90%汇合。

（2）SNL 细胞传代
1）弃废液，PBS洗细胞，弃PBS，加入0.25%胰酶/1mmol/L EDTA 每皿0.5ml，孵育1分钟。

2）加入4.5ml SNL液体，并吹吸成单细胞，按1∶16比例传代，于37℃，5%CO2培养直至细胞汇合率80%～90%。

（3）丝裂霉素-C处理SNL细胞
1）每皿SNL细胞加入0.3ml浓度为0.4mg/ml的丝裂霉素-C，混合均匀，于37℃，5%CO2培养2.25小时（丝裂霉素-C终浓度为
12µg/ml）。

2）孵育完成后，弃所有液体，并用PBS洗两次。

3）弃PBS，加入0.25%胰酶/1mmol/L EDTA 0.5ml，液体盖满皿底，室温下1分钟，加入5ml SNL液体以中和胰酶作用，吹吸成单细胞。

4）收集悬液，细胞计数，将细胞接种于明胶铺被的皿底（1×106 细胞/100mm皿）。

3.Plat-E细胞准备
（1）细胞复苏
1）由液氮罐中取出Plat-E冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，并晃动冻存管直到融化。

2）乙醇擦拭冻存管盖及冻存管壁，将管内冻存悬液转移入预先准备的SNL液体中，1000r/min×5min离心，弃去上液。

3）重新加入10ml FP液体重悬细胞，转入明胶铺被的100mm皿中，于37℃，5%CO2培养。

4）次日，换液并加入1µg/ml嘌呤霉素和10µg/ml杀稻瘟菌素，置培养箱中培养至汇合率80%～90%。

（2）传代
1）加入PBS洗后，加入0.05%胰酶/0.53mmol/L EDTA每皿4ml，消化1分钟，吹打，用10ml FP液重悬，1000r/min×5min离心，弃去上液。

2）加入相当FP液体，重悬成细胞悬液，以1∶4～1∶6的比例接种到新的100mm皿中，细胞培养2～3天会铺满皿底。

（3）转染前准备
1）用PBS清洗细胞，加入0.05%胰酶/0.53mmol/L EDTA消化1分钟，用10ml FP液重悬，1000r/min×5min离心，弃去上液。

2）重悬细胞，调整细胞浓度至8×105/ml，接种8×106/100mm 皿，于培养箱培养。

（4）转染
1）吸取0.3ml DMEM液体于1.5ml管中，加入27µl Fugene 6转染试剂，手指轻弹管壁以混合均匀，室温放置5分钟。

2）加入9µg pMXs质粒 DNA（编码 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc）逐滴加入到上述管中，轻弹混匀，放置 15分钟。

3）将上述混合物逐滴加入至Plat-E皿，于培养箱孵育过夜。

4）弃转染液，加入10ml新鲜FP液，培养。

4.成纤维细胞准备
（1）培养MEF（约2×106/100mm，代次在3代以内）至90%汇合度。

（2）10ml PBS洗细胞，弃PBS加0.05%胰酶/0.53mmol/L EDTA，每皿1ml，培养箱孵育10分钟。

（3）加入9ml培养液，将消化得到的单细胞转移至50ml离心管。

（4）细胞计数，调整细胞浓度至8×104/ml，加10ml细胞悬液于经丝裂霉素-C处理的SNL的100mm皿中，培养过夜。

5.逆转录病毒感染
（1）收集上述Plat-E培养液，经0.45µm细胞滤器过滤，转入15ml管中。

（2）加5ml的8mg/ml的聚凝胺溶液于上管中，吹打混匀，终浓度为4µg/ml。

（3）弃成纤维细胞培养液，加入10ml上述转染混合液中，培养过夜。

（4）24小时、48小时后换新鲜FP液体。

（5）为 Fbx15βgeo/βgeo筛选，换液 10ml ES 培养液，补充0.3mg/ml G418，换液 3次。

（6）为 NanogGFP-IRES-Puro筛选，培养液，中加入嘌呤霉素，终浓度为1.5µg/ml。

（7）每天换液直至克隆出现（约为感染后1周），约20天可挑克隆。

6.挑克隆
（1）加入20µl 0.25% 胰酶 /1mmol/L EDTA 每 96 孔；弃液，加 PBS 10ml。

（2）弃液，再加入5ml PBS，吸取挑起的克隆转入上述96孔板中，孵育15分钟。

（3）加入ES培养液每孔180µl，吹打克隆成单个细胞。

（4）转移细胞悬液于铺有SNL饲养层细胞的24孔板，加入
300µlES培养液，培养箱孵育。

7.iPS培养
（1）弃液，1ml PBS 清洗细胞。

（2）去尽PBS，加入0.25%胰酶/1mmol/L EDTA 0.1ml，放于培养箱孵育10分钟。

（3）加 0.4ml ES培养液（含 15%FBS，2mmol/L L-谷氨酰胺，1×104mol/L 非必需氨基酸，1×104mol/L β-巯基乙醇，
50U&50mg/ml青霉素和链霉素的DMEM液），吹打至单细胞悬液，转移至6孔板，加入1.5ml ES培养液，培养箱培养至汇合度80%～90%。

8.iPS冻存
（1）弃液，加入 2ml PBS 清洗。

（2）去除PBS，加入0.3ml 0.25%胰酶/1mmol/L EDTA，培养箱孵育10分钟。

（3）加入2ml ES培养液中和胰酶作用，吹打成单细胞，计数，800r/min×5min离心。

（4）弃上液，重悬细胞调节细胞浓度至2×106/ml。

（5）配制细胞冻存液（含20%DMSO的ES培养液），加入离心后细胞，吹打均匀，分入冻存管，放于冻存盒，后转入-80℃冰箱过夜（为长期冻存，可放于液氮罐储存）。

二、大鼠iPS细胞的获得
现在iPS诱导的方法很多，这里以最常见的逆转录病毒载体感染大鼠胚胎成纤维（MEF）细胞为例做一个介绍，主要步骤包括：【含4种转录因子的病毒载体包装】
293细胞培养：复苏293细胞，接种在gelatin包被的培养皿中，培养基为DMEM加10%血清。

在37℃，5%CO2环境培养。

待细胞密度达到80%～90%时传代。

载体转染：将含4种转录因子的病毒载体转染到293细胞中，病毒在细胞内包装完成，48小时后收集上清。

上清超速离心，病毒颗粒沉淀用MEF细胞培养基重悬。

【病毒感染大鼠成纤维细胞】
大鼠成纤维细胞培养：培养基为DMEM加10%血清。

在37℃，5%CO2
环境培养。

当细胞培养至3代左右细胞状态较好时即可进行转染。

感染过程：将大鼠成纤维细胞的原培养基吸去，加入含有病毒颗粒的大鼠成纤维细胞培养基，培养过夜。

换新鲜无病毒大鼠成纤维细胞培养基。

并在病毒感染24小时后，换大鼠胚胎干细胞培养基。

【挑克隆，细胞培养】
feeder细胞准备：将新的MEF复苏传代于24孔板，当细胞密度达到90%时，用丝裂霉素C处理4小时，吸去培养基，用PBS洗5次。

然后加入胚胎干细胞培养基。

经转染的细胞每天更换胚胎干细胞培养基，直到ES样克隆长到足够大，开始挑克隆。

吸去培养基，用PBS
洗两遍。

然后在显微镜下找到克隆，将0.2～2µl的移液枪调到2µl，用Tip头刮下克隆，并将克隆吸到96孔板的孔里。

向有单克隆iPS
细胞的96孔板中加入0.25%的胰酶20µl，37℃消化4分钟，立即加
入ES培养基100µl，终止消化。

轻轻吹打10次后，将克隆转到有feeder的24孔板中继续培养。