顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究
细胞凋亡作为生物细胞对内外信号刺激的一种反应，在正常细胞的发育过程中精确调控细胞
的死亡过程。

肿瘤的发生与正常的细胞凋亡过程被抑制，破坏了细胞增殖与凋亡之间的平衡
有一定关系。

顺铂因其可抑制癌细胞的DNA复制过程，抑制癌细胞分裂，而被广泛应用于临
床治疗肿瘤。

我们观察了顺铂对肝癌细胞株HepG2凋亡的诱导作用，从而探讨其作用机制。

1 材料与方法
1.1、药品和试剂：RPMI-1640培养基（购自Gibco公司），胎牛血清（coring公司），顺铂（Gibco公司），Annexin-V/PI试剂（Invitrogen公司）。

倒置显微镜（尼康TS100F）流式细
胞仪（Beckman Coulter公司）。

1.2 方法
1.2.1 细胞系及培养：人肝癌HepG2细胞株引自大连医科大学中心实验室。

用含10%胎牛牛
血清、100 u/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液, 在37 ℃、5% CO2 条件下作
常规悬浮培养，每2-3天换液传代培养。

1.2.2 细胞培养及药物处理：取对数生长期细胞，细胞用0.25%胰蛋白酶消化后,配成5×105/L
的细胞悬液分别接种于24孔板中培养，24 h细胞贴壁后，弃上清。

实验组分别加入浓度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL的顺铂处理细胞，对照组不加药，另
设空白对照组（只有培养基，无细胞），每组设置复孔，全湿条件下，37℃、5% CO2 培养箱中培养。

1.2.3 细胞形态学观察：取对数生长期细胞, 以每孔5×105个接种于6孔板中,24 h细胞贴壁后，弃上清。

分别加入不同浓度顺铂处理细胞，每6 h于倒置显微镜下观察活体细胞形态。

1.2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡：实验组，对照组和空白对照组细胞培养24h，48h后用0.25%胰蛋白酶消化，PBS漂洗两次，调整细胞浓度至106/mL，取100μl细胞悬液，加入5μl Annexin－V/FITC 10μl及浓度为50μg/mL的PI液10μl，室温避光孵育15分钟后，加入PBS液400μl，用流式细胞仪进行流式细胞术定量检测。

1.3 统计学分析：用SPSS13.0软件进行统计学处理，统计数据用χ±SD表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果
2.1 顺铂对HepG2 细胞细胞形态学的影响：HepG2细胞经顺铂处理后，即可见肝癌细胞由贴
壁而脱落，悬浮于培养瓶中，细胞形态变圆，体积缩小，核固缩出现，核颜色加深，折光性
加强，随着顺铂浓度的加大，细胞凋亡程度越大。

凋亡程度随着药物作用时间的延长而加大。

2.2 流式细胞仪结果：流式细胞仪结果，不同浓度的顺铂在一定时间范围内处理HepG2细胞
后凋亡细胞群与对照组比较有显著增加，差异有显著性(P<0.01)，同一时间不同浓度各组比较也有差异，P<0.05 。

3 讨论
细胞凋亡(apoptosis) 是由基因控制的细胞自主的有序性死亡,又称为程序性细胞死亡(programed cell death，PCD), 是真核细胞的一种特殊的死亡形式。

细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、神经病变等生理、病理过程密切相关[1]。

肿瘤共同的生物学特征是失
控性生长，其主要的分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增生过多和凋亡减少，因此诱导肿瘤
细胞分化、凋亡已经成为肿瘤治疗的重要手段之一。

顺铂（Cisplatin）是一种含铂的抗癌药物，属于细胞周期非特异性药物，对多种细胞肿瘤都
有治疗功效。

顺铂进入机体后，一个氯缓慢被水分子取代，形[PtCl(H2O)(NH3)2]+，其中的水
分子易脱离，从而铂与DNA碱基一个位点发生配位，然后另一个氯脱离，铂与DNA单链内
两点或双链发生交叉联结，抑制癌细胞的DNA复制过程，使之发生细胞凋亡[2]。

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞
膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中[3]。

Annexin-V是一种分子量为35～
36KD的Ca2+依赖性磷脂丝氨酸结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行
荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜可以检测细胞凋亡的发生。

本文我们采用顺铂来作为肝癌细胞株HepG2凋亡的诱导剂，并用形态学及流式细胞仪等检
测发现：顺铂能够抑制HepG2增生，且随着药物浓度增加，作用时间延长，HepG2细胞生长
率逐渐降低，抑制作用呈现明显的时间－剂量依赖性；细胞凋亡过程伴随着一系列形态特征
改变，顺铂作用于HepG2细胞后，光学显微镜下可以见到典型的细胞凋亡形态；流式细胞检
测发现细胞凋亡率增加，并呈时间－剂量依赖性。

我们以HepG2细胞为模型，通过严格的体外实验证实：顺铂对于体外培养的HepG2细胞具
有增生抑制和诱导凋亡作用。

参考文献
[1]Sgonic R,GruberJ.Apoptosis detection :an overview .Exp Gernontol 1998:33(6 ):525一33.
[2]Stordal, B. and Davey, M. (2007). Understanding cisplatin resistance using cellular models. IUBMB Life. 59(11) 696-699
[3]Vermes I,HaanenC,Steffens-NakkenH,A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled AnnexinV,J Immunol Methods 1995; 184(1):39—51.
表1 顺铂作用后HepG2细胞凋亡率检测结果（%）。