HPLC测定液体制剂中维生素K1含量的方法学验证

HPLC测定液体制剂中维生素K1含量的方法学验证
作者：王亚男
来源：《科技资讯》2019年第19期
摘 ;要：目的建立液体制剂中胶束型维生素K1的含量测定方法。

方法采用Ultimate XB-C18色谱柱（5μm，4.6mm×150mm），乙醇：水（9∶1）作为流动相，流速为1.0mL·min-1，检测波长为269nm，进样量为20uL。

结果维生素K1浓度在20.04～200.8ug/mL这之间线性关系良好。

平均回收率为99.95%，RSD为1.05%。

结论该检测方法准确、方便，可以作为液体制剂中维生素K1含量测定的方法。

关键词：HPLC ;胶束 ;液体制剂 ;维生素K1 ;方法学验证
中图分类号：R927 ; 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2019）07（a）-0251-02
维生素K1主要用于治疗体内缺少维生素K1从而出现内脏等出血现象的病症，VK1目前基本上药物应用划分在止血药物这一领域，临床上主要以维生素K1注射液的形式给药[1]。

维生素K1不仅治疗效果明显，而且还具有药价亲民等优势。

然而维生素K1的溶解性较差限制了它的使用范围，这一类药物由于其溶解度都很低从而也导致了其生物利用度在很大程度上大打折扣，从而限制了这一类难溶性药物在临床应用领域的发展[2]。

随着药剂学的不断发展，并且通过搜索国外目前市售新型的维生素K1注射液新剂型，我们发现磷脂胆盐胶束作为增溶系统中的一种，可以非常明显地提高该类药物的水溶性[3]，并且几乎对人体不会产生毒副效应。

胶束型维生素K1注射液在国外临床上已经应用多年，是非常优良的难溶性药物的增溶载体。

该研究主要就是对磷脂胶束中维生素K1含量测定[4]的高效液相色谱方法进行方法学验证，为后期开发该类产品提供科学有效的研究依据。

1 ;材料和仪器
1.1 材料
维生素K1原料药（山东广通宝医药有限公司）;蛋黄卵磷脂（含量约为80%，日本丘比株式会社）;胆酸钠（重庆卡兰医药有限公司）;盐酸（德州迈化）;氢氧化钠（德州迈化）;乙醇（色谱级，Fisher）。

1.2 仪器
万分之一电子分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）;LC-2010 型高效液相色谱仪（岛津，日本）;数控超声水浴锅（江苏盛蓝仪器公司）;恒温鼓风干燥箱（型号：YP-250SDP 上海迈捷仪器有限公司）;pH计（型号：STF5000/F，OHAUS/奥豪斯，美国）。

2 ;方法与结果
2.1 溶液的配制
（1）标准溶液配制。

准确称取维生素K1原料药10.1mg，胆酸钠54.2mg，磷脂53.9mg，加流動相溶解定容，配制为5.01mg/mL的维生素K1样品贮备液。

（2）供试品溶液配制。

准确称取处方量的磷脂及维生素K1，加入适量的三氯甲烷溶解，减压蒸馏，蒸干成膜后，缓慢加入适量注射用水，震荡溶解，水浴超声45min。

将超声后的溶液过滤，去滤液，即得维生素K1磷脂胆盐胶束溶液。

2.2 含量测定方法学验证
2.2.1 色谱条件
色谱柱：Ultimate XB-C18色谱柱（5μm， 4.6mm×150mm）;流动相：乙醇∶水（9∶1）;检测波长：269nm;柱温：30℃;流速：1.0mL·min-1;进样量：20uL。

并且以上HPLC条件，理论塔板数用维生素K1计要不小于2000，另外，药物与相邻杂质之间的分离度要符合要求。

2.2.2 系统适应性试验
取维生素K1待测溶液，按照2.2.1项下的含量测定方法用高效液相色谱仪进样测定，实验结果说明该流动相乙醇∶水（9∶1）下的峰型对称度良好，且与杂质和溶剂在这个系统条件下的分离度较优。

2.2.3 空白辅料干扰实验
准确称取磷脂和胆酸钠，即空白辅料，加入乙醇稀释定容，作为辅料溶液，配制成与样品测定浓度相同的空白辅料溶液，分别按照2.2.1项下的含量测定方法进样测定，经过检测结果图谱对比，可见辅料在维生素K1主峰位置处以及周围无色谱峰，因此辅料对维生素K1主药的测定没有干扰。

2.2.4 线性试验
准确称取维生素K1原料药10.1mg，甘氨胆酸钠54.2mg，磷脂53.9mg，加流动相溶解定容，配制为5.01mg/mL的维生素K1样品贮备液。

精密量取上述溶液，加乙醇将维生素K1贮备液分别定量作20.04ug/mL，60.03ug/mL，80.02ug/mL，101.3ug/mL，120.9ug/mL，
141.4ug/mL，200.8ug/mL，一系列标准溶液。

在上述HPLC方法条件下测定，对主峰面积A和浓度C用Excel软件计算，从而计算结果得到标准曲线方程。

得出实验结果：维生素K1的浓度在20.04～200.8ug·mL-1范围时的线性方程为
A=210149C-13064，相关系数R2=0.999，由此得出结论，进样量在20uL时，维生素K1浓度范围在20.04～200.8mg/mL内线性关系良好。

2.2.5 准确度
准确称取维生素K1原料药，依法配制成测试浓度的80%、100%、120%3个不同浓度的溶液作为待测溶液，3个浓度溶液各配制3份;另依照上述方法配置3个浓度的标准溶液，共计9份溶液。

取上述供试品溶液和对照品溶液分别进样，记录HPLC色谱图，计算实验结果。

得出实验结果：在3个不同浓度下的回收率分别都在98.0%～102.0%之间，计算得出的平均回收率是100.01%，RSD%是0.18%，说明该实验所采用的方法具有良好的回收率，准确度符合规定。

2.2.6 定量限和检测限
准确称取维生素K1，用乙醇溶解维生素K1稀释制成100mg/mL溶液，作为检测限和定量限测定时备用的贮备液。

分别对上述溶液用乙醇稀释，进样检测，当S/N约10时测定结果定为定量限，定量限浓度为120ng·mL-1，连续进样6针;当S/N约3时，结果得到的检测限浓度为20ng/mL。

試验结果：定量限连续6针的峰面积相对标准差1.01%，小于2.0%，符合试验的要求，检测限为0.4ng，说明该方法的检测灵敏度较高。

2.2.7 精密度
（1）检测仪器精密度。

取VK1对照品溶液100ug/mL，取该样品进样，连续进样6针，进行含量测定并计算，结果表明：平均峰面积计算得出的结果是2592423.7，RSD是0.19%，其结果RSD<2.0%，说明该方法的进样精密度好。

（2）重复性。

准确称得维生素K1，用乙醇稀释溶解定容，配制对照品6份，同时配置供试品6份，按照上述方法进行试验，结果表明：经考察后，供试品的平均含量为99.59%，测得RSD为0.73%，符合要求的RSD小于2.0%，说明该实验方法的中间精密度良好。

2.2.8 溶液稳定性
准确称取维生素K1，用乙醇稀释定容，制备待测贮备液。

取维生素K1贮备液，配置成100ug/mL的供试品溶液，分别于第0、2、4、6、8h，测定供试品溶液的含量，考察维生素K1
混合胶束溶液的稳定性。

由以上结果可知：维生素K1混合胶束溶液在室温条件下放置8h均稳定，满足稳定性实验测定的要求。

3 ;结语
综合上述实验结果表明：空白辅料对维生素K1胶束型液体制剂的含量测定无干扰;测得线性、精密度（其中包括重复性和中间精密度）、定量限、检测限、回收率均符合方法要求，并且溶液在室温条件下放置8h，测定后的结果均稳定。

因此，该方法可以应用于维生素K1胶束型液体制剂中维生素K1的含量测定，为后期维生素K1注射液新剂型（磷脂胆盐胶束）的研究奠定基础。

参考文献
[1] 孟新芳，曹永孝，刘海静.对维生素K1注射液不良反应的思考[J].学争鸣，2012（6）：44-46.
[2] 张勇，陈玉威，高桂花.HPLC法测定多维元素片（29）中维生素K1的含量[J].实用药物与临床，2007，10（3）：189-190.
[3] 姜瑞清，周琳，胡桂林，等.对GB 5413.10-2010中维生素K1检测的改进研究[J].中国乳品工业，2011，39（9）：50-52.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：623-625.。