葡聚糖凝胶柱使用及注意事项

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项
1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。

其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。

虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。

此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。

2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。

用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。

如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件：
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。

首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。

极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。

我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。

(2) 饱和层析柱：
用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。

至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。

(3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。

(4) 湿法上柱。

这也是要有技巧的步骤。

(5) 洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。

再生以备下次使用。

6 分离的技巧，最后说说我的使用心得
（1）流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。

（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。

所谓集中
优势兵力，打击敌人。

（3）馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。

（4）洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。

（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。

（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。

Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。

例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等，Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。

1.装柱
装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。

胶颗粒越均一（粒径分布越窄），越容易获得稳定均一的柱床。

但是对于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。

然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。

这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。

在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。

Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。

在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。

在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。

使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。

将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。

2.平衡
上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。

3.洗脱液
为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。

4.样品
样品体积应该占柱总体积的1-2%，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um 的膜过滤。

5.洗脱
洗脱流速应根据情况而定，最大线性流速约12cm/min（反压1.5ba），建议流速为1-10cm/h。

总体来说，较低的流速，具有较高的分辩率。

6.再生
凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗，如更换洗脱液，则需要重新平衡。

7.体积流速与线性流速的关系
线性流速=体积流速/横截面积
8.溶胀体积
由于Sephadex LH-20的溶胀体积依赖于溶剂，所以对于不同直径的柱可根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。

新体积=旧体积×（新柱体积/旧柱体积）
9.胶的性质
Sephadex LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。

10.排阻极限 4-5KD（与所用溶剂有关）
11.上样量
吸附模式取决于所需分辩率
分子量大小小于总体积的20%
正相分配小于总体积的1%
12.其他
胶粒形状球形，多孔
颗粒大小（干） 18-111um（直径）
颗粒大小中间值（干） 70um（直径）
颗粒大小（甲醇） 27-163 um（直径）
颗粒大小中间值（甲醇） 103 um（直径）
最大线性流速 720cm/min
参考线性流速 60 cm/min
pH的稳定性
操作中 2-11
清洗中 2-13
化学稳定性在许多水溶液及有机溶剂系统中都稳定。

在pH2以下或强氧化剂中不稳定
高压灭菌121℃可忍受20分种
操作温度4℃到40℃
保存条件
新填料 4-25℃（干燥）
使用后填料 4-8℃，pH6-8，切勿冷冻，加入抑菌剂（如20%乙醇，0.04%叠氮钠）
13.干胶溶胀表
溶剂床体积（mL凝胶/g干胶粉末）
Dimethyl sulphoxide 二甲亚砜 4.4～4.6
Pyridine 嘧啶 4.2～4.4
Water 水 4.0～4.4
Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.8～4.2
Saline 生理盐水 3.9～4.1
Methanol 甲醇 3.8～4.1
Methane dichloride 二氯乙烷 3.8～4.1
Chloroform* 氯仿 3.8～4.1
Propanol 丙醇 3.7～4.0
Ethanol** 乙醇 3.6～3.9
Isobutanol 异丁醇 3.6～3.9
Formamide 甲酰胺 3.6～3.9
Methylene dichloride 二氯甲烷 3.6～3.9
Butanol 丁醇 3.5～3.8
Isopropanol 异丙醇 3.3～3.6
Tetrahydrofuran 四氢呋喃 3.3～3.6
Dioxane 二氧杂环已烷 3.2～3.5
Acetone 丙酮 2.4～2.6
Acetonitrile*** 乙腈 2.2～2.4
Carbon tetrachloride 四氯化碳 1.8～2.2
Benzene 苯 1.6～2.0
Ethyl acetate 乙酸乙酯 1.6～1.8
Toluene 甲苯 1.5～1.6
*包含1％的乙醇
**包含1％的苯
***溶胀胶体积小于2.5mL/g的溶剂没有使用价值
Sephadex LH20使用心得谈：
1 Sephadex LH20是一种价钱较高的填料，使用请千万注意，很贵的哟！（当然，老板有钱就另当别论拉）
2 先讲Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

3 再讲Sephadex LH20 洗脱溶剂。

听我讲完第2点后，其实就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。

用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。

如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－
甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 分离的技巧，最后说说我的使用心得
（1）流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。

（2）柱子尽可能长，Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。

所谓集中优势兵力，打击敌人。

（3）馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。

（4）洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。

（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质
（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。

（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用
问：在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响.还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?
解答如下:
1 "在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响."
当然有影响,Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何填料都是这样,只是Sephadex LH20很明显),一般在丙酮，乙酸乙酯中收缩很厉害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯作溶剂,如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
丙酮0.8ml
乙酸乙酯0.4ml
甲苯0.2ml
2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?"
样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同，但有时（其实是多数情况下），都办不到。

对Sephadex LH20上样样品的要求是
1 样品一定要溶解（Sephadex LH20很贵，要保护填料，我看植化的同志对好填料看得都很重，职业问题，哈哈哈；同时，避免样品不溶解造成的脱尾）
2 溶解样品的体积尽可能小（色谱分离理论的基本要求，减小原始谱带宽度）
3 样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同（若样品的溶解溶剂比洗脱的起使浓度洗脱能力强，则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力；同时若样品的溶解溶剂与洗脱的起使溶剂差别很大，样品可能以为溶解性的问题而析出。

）
以上三点是上样的基本要求，有时很难求全，只有根据具体的实际来决定了。

一般我的做法是满足1，2点，尽量满足第三点，“如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解”，请注意我的陈述“尽可能”，
3 "还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?"
如果实验室Sephadex LH20很珍贵，分道较纯再用，如果实验室Sephadex LH20很普及，只要满足使用的注意事项，较粗的样品可直接使用Sephadex LH20分离。

日本的师兄都是用Sephadex LH20粗分，人家有钱，所以不在乎。

如果硅胶比Sephadex LH20还贵，你一定先用Sephadex LH20粗分，再用硅胶吧。

有很多问题根本不是学术本身的问题，人也不可能在真空中搞科研。

哈哈，跑题了。

问：那上样体积与柱体积最小的比是多少？我用100克的填料，如果样品不好溶，那一次最多能上多少毫升的样呢？
1 在分离过程中遇到要分离的样品量很大,而柱层填料相对较少的情况是很多的.一般解决的途径有两条:
1）将样品一次全上柱,这样分离效果一定不会好,但我们的侧略是将样品交叠的部分再上一遍或几遍,这叫反复xxxx柱层，好处是工作量小（对比下面就知道了），在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，可就乐去吧。

2 ）将样品分几次分别分离，这样每次分离的效果一定比将样品一次全上柱的分离效果好，但这样有一个很大的弊病，就是每次柱层的条件不可能保持完全一至，这样几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层馏分合并的过程中，合的太粗，就如同将样品一次全上柱的合并结果，只是工作量增大了。

如果心中不甘，你中有我我中有你的馏分，我也不知怎么合并了。

所以推荐的做法是将样品一次全上柱，再通过反复柱层的方法来逐步提高分离效果，
唉呀，我嘴苯，不知有没有说清。

2 100g填料已不少了，astra兄的样品如果实在太多，就只好分开上柱了.
3 一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定，在柱床体积的1／10吧。

问：分得效果不是很好，上了有8毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差不多，很让人困惑，郁闷。

不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说的是Sephadex LH20不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,
1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是Sephadex LH20这种填料的特点:"洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积",
2 "我用甲醇洗脱,而且仍然和没上柱之前差不多",说明你的样品组分之间分子大小差别不大,所以Sephadex LH20的凝胶过滤作用不起作用了,如果你还用Sephadex LH20分离,那你应该利用他反相分配的作用,即先用低浓度的甲醇/水,逐渐提高甲醇比例,最后才用甲醇洗脱.
1 A君提到用少量的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理,是指甲醇水难蒸干吗?其实这根本不应成为问题.astra君请想一想,做植化的,哪有遇不到甲醇水的时候, ODS柱层用甲醇水洗脱, Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱,D101用乙醇水洗脱, HP20 用甲醇水洗脱, 高效液相最常用的是反相, 流动相还是甲醇水,可见甲醇水是植化同志最亲密的朋友! 所以蒸不干也要蒸,想想办法吗!
2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的,,办法是有的,先看看旋转薄膜的几个要素: 真空度, 冷凝液, 蒸发温度.
1) 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性.一般的国产水泵就能满足日常的需要(包括蒸水),但一定注意的是水泵的循环水一定要开,如果不开循环水,水泵中的水很快就会变得很热,将极大地减少水泵的效率,且会将抽出的溶剂挥散出来,很不好! 比国产水泵更好的是进口水泵,比进口水泵更好的是隔膜泵,系统的密闭性就更重要了,特别是蒸像水,丁醇这样的溶剂,对系统的密闭性的要求很高,对于系统密闭性不好时,可采用逐步拆分法来查漏,最容易出问题的地方在垫圈,国产的旋转薄膜配的垫圈很烂,全不耐氯仿等有机溶剂,当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂,垫圈就废了.所以要多预备几个垫圈.
2) 冷凝液一般使用水,如果配一台冷阱,使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液, 效果棒极了
3) 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率,但可能发生物质的变化,国产旋转薄膜,水泵,用水冷,当然就只好提高蒸发温度了
我用东京理化的旋转薄膜,1/2汽车冷冻液冷凝,隔膜泵,蒸水不到45度,很爽!
3 向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到30%,蒸出速度将大大提高!
Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤, 将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可,
2 如果柱子整个被污染,如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下
依次用水,NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。

因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。

NaOH-NaCl水溶液配法：8g NaOH ,30g NaCl，1000ml水
看了上面战友们的讨论，感觉受益菲浅。

小弟也来班门弄斧，发言不对之处，请各位兄台指正：
Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。

此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。

虽然价位很
高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。

此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。

我用Sephadex LH-20的步骤是：
1.选择条件：
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。

首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。

极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。

我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。

2.饱和层析柱：
用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。

至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。

3.样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。

4.湿法上柱。

这也是要有技巧的步骤。

5.洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。

6.再生以备下次使用。

问：不知道用反响柱分离合用LH-20那个效果比较好.同时如果用同一根LH-20的话,洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题,上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?最后用甲醇冲柱就可以了吧??
1.Sephadex LH-20主要还是分子筛的作用机理，在非极性溶剂中有一定的反相柱效果。

如要分离的物质在反相板上分离效果好，那么大可在反相柱中进行分离;如果要分离的物质分子量相差较大，当然是Sephadex LH-20效果好。

实际使用中往往上在一起配合使用，逐渐细分为多个部分直到拿到纯品。

2.Sephadex使用时一般不进行梯度洗脱（洗柱的时候当然要换）。

如果改变流动相的极性，会改变凝胶的膨胀率，分量不同的物质在网孔改变过程中引起交错，反而达不到分离效果。

如果要分离的样品中极性相差较大，可以细分为不同的极性段再上Sephadex LH-20
我们实验室用的LH-20柱一般就是甲醇：二氯甲烷（1：1）作流动相，如果冲不干净就换纯甲醇来冲，没碰到过你说的情况！根据LH-20在不同溶剂中的溶涨程度不同，如果你用的溶剂溶涨系数接近的话，可能影响不大，如果溶剂之间溶涨系数相差较大，我想出现气泡是可能的。

（借用前面同学提供的数据）
以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
乙酸乙酯0.4ml
甲苯0.2ml
丙酮0.8ml。