PI染色法测细胞周期

2 凋亡研究
在G0/G1峰前出现一 个亚二倍体峰;即凋 亡峰
检测调亡;可进行抗 肿瘤药物研究和某些 因素对细胞的损伤机 理的研究
Annexin V Assay
R1
File: 4
Acquisiti on Date: 06-Mar-03
Quad UL UR LL LR
Events 254
通过核酸染料标记DNA;并由流式细胞仪 进行分析;可以得到细胞各个时期的分布 状态;计算出G0/G1;S及G2/M的百分含量; 了解细胞的增殖能力；结合DNA指数分析; 还可进行凋亡 异倍体等检测
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
PI染色法测细胞周期
一 细胞DNA含量检测
细胞固定后用PI Propidium iodide碘化丙啶;染色;因为PI特异性 结合于细胞DNA;荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系;根据 这个原理;可测出细胞的DNA含量 用于细胞周期 细胞倍体以及凋 亡的检测
单参数直方图
图中2N代表G0/G1期细胞;4N代表G2/M期细胞;两者中间代表S期 细胞 这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图
图 FCM测试细胞周
R1
期分布和凋亡
根据凋亡细胞的特点来检测
在形态上;早期细胞核固缩;染色体边集在核膜 内侧显新月体形 核碎裂；细胞浆和细胞器密 度增高 细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲;但早 期细胞膜的完整性未受到破坏
凋亡细胞的FSC SSC 细胞坏死时;细胞肿胀;FSC ;SSC
正常人静止体细胞有46条染色体;相当于 7 1012 pg DNA/细胞核;我们称之为二倍 体细胞;而正常增殖细胞则存在不同的 DNA含量 在细胞周期G0;G1;S;G2 ;M的各 个时期;DNA含量随各时相呈现出周期性 的变化：在G1期;细胞开始RNA和蛋白质 的合成;但DNA含量仍保持二倍体；
进入S期后;DNA开始合成;这时细胞核内DNA的含 量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体 时;细胞进入G2期;G2期细胞继续合成RNA及蛋白 质;直到进入M期;因此;单纯从DNA含量无法区分 G2期和M期；一旦有丝分裂发生;细胞分裂成两个 子细胞;这两个子细胞或者进入下一个细胞周期; 或者进入静止期G0期;而G0期从DNA含量上同样无 法与G1期区分 因此;整个复制周期可以描述为 G0/G1;S;G2/M期
加入800ulPI染液;用枪轻轻吹打细胞团; 混匀;室温避光染色30min
上机检测
影响荧光染色的因素
温度：温度高于20℃时;即出现温度淬灭 2 PH：PI在7 2~7 6;保持荧光染料分子与
溶剂间的电离平衡 3 荧光染料浓度：染料太少;结合不完全
染料过多;又会出现浓度淬灭现象 4 固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料
1067 5291 3975
% Gated 2.40
10.08 49.98 37.55
X Mean 37.47
816.86 19.57
418.80
Y Mean 461.36 468.89
4.41 9.87
图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死
Date acquired: 14Jan03 File: 7Gy 4hr 001 Source: dongbo DIPLOID: 100 00 % Dip G0G1: 73 12 % at 48 16 Dip G2M: 9 59 % at 96 33 Dip S: 17 29 % G2/G1: 2 00 Dip %CV: 6 04 Apoptosis: 13 66 % Mean: 27 48
DNA细胞周期分析
G2 M
G0
G1
细
s
胞 数
量
细胞周期
DNA分析
G0G1
s G2M
2N
200

4N DNA含量
600
800
1000
肿瘤组织中的各种DNA倍体
2倍体
异倍体
4倍体
含量与凋亡关系
DNA亚G1峰的检测：利用PI染色;检测具有亚 G1期DNA含量的细胞比例;代表凋亡细胞数
凋亡过程中;细胞内核酸酶的释放;将DNA降解; 分解成小的片段;在标本制备中的固定处理时; 细胞膜的完整性被破坏;使细胞内降解的DNA 片段从细胞内流出;造成总体DNA含量减少;成 为亚2倍体
染料的选择取决于流式激光的配置 488nm的激光下应用PI碘化丙啶;由于PI 也与RNA结合;所以分析前样本应用Rnase 处理 重要的是染料要足够;以保证饱和 结合 PI的推荐浓度是至少20ug/106 个 细胞 其最佳浓度为50ug/106 个细胞
操作步骤
取一瓶生长期的A549细胞;倒掉瓶中旧的培养 液;加入3mlPBS;细胞生长面在下轻轻晃动细 胞瓶;然后去掉液体;加入1ml胰蛋白酶消化 1~5分钟以镜下观察决定
与核酸分子的结合;造成荧光发射强度减 弱
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
细胞浓度及质量要求
单细胞和核的上机浓度应约106/ml 浓度 太低;上机时样本的流速不得不提高;这 样就会影响检测的CV 浓度太高;则可能 导致染料的相对不足;最终使染色不饱和; 同样影响CV和检测结果
制备完成后的标本应用光学显微镜检查 其质量：细胞是否聚集或过多的碎片
加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面;制成细胞 悬液;将细胞悬液移至15ml离心管中1500rpm 离心5min;去上清
加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液;在 旋涡状态下逐滴加入2ml20℃95%冷乙醇;混 匀后固定30min
加入5mlPBS;1500rpm离心5min;去上清 液
加入5mlPBS重悬细胞;1500rpm离心 5min;去上清液