免疫电泳实验报告

免疫电泳实验报告
摘要：本实验运用火箭电泳、微量电泳、双向免疫扩散等方法测定抗体的效价。

关键词：抗体效价测定；火箭电泳；微量电泳；双向免疫扩散
1 前言
免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法很多，主要有单向免疫扩散、双向扩散电泳、对流免疫电泳、微量免疫电泳、免疫火箭电泳、免疫固定电泳等几种方法。

其中比较常用方法有以下三种。

火箭免疫（rocket immunoelectrophoresis），该方法是在琼脂板内掺入适量的抗体，在电场的作用下定量的在含适量抗体的离子琼脂中泳动，当走在前面的抗原遭到琼脂板内的抗体时，形成抗原体复合物而沉淀出来，走在后面的抗原继续在电场的作用下向正极泳动，在向前泳动过程中，遇到了前面抗原所沉淀的抗原抗体复合物，由于抗原的增加造成抗原过量时复合物沉淀溶解，并一同向正极移动而进入新的琼脂板内与未结合的抗体结合，有形成新的抗原抗体复合物沉淀出来，这样不断地沉淀—溶解—再沉淀，直到全部抗原与抗体结合，当比例合适时，可在短时间内出现锥形沉淀线，此沉淀线形似火箭，故称火箭电泳，抗原含量越高所形成的火箭峰愈长，因此依据火箭峰的长度，与标准抗原比较精确地计算抗原的浓。

微量电泳，该方法的原理是不同蛋白质颗粒所带电荷不同，在同一电场中，因泳动速度不同而发生分离，用于抗原、抗体纯度测定，以及临床诊断。

双向免疫扩散（double immunodiffuison）,根据出现沉淀线时抗体的最高稀释度来计算抗体的效价，或者依据沉淀线的出现定性抗原，检测疾病。

2 材料与方法
2．1 材料抗体，抗原，巴比妥钠-HCl缓冲液（pH8.6，0.4M），1.5%琼脂糖凝胶，7%醋酸，电泳仪，温箱，玻璃板，打孔器等。

2．2 方法
2．2．1 火箭电泳法配制巴比妥钠-HCl缓冲液（pH8.6，0.4M）；制备1.5%琼脂糖凝胶，煮沸至完全溶解；取琼脂糖凝胶约15ml，置55 ºC水浴中降温，并加入抗体200μL，共同孵育；将二者混匀，铺火箭电泳板，放置冷凝倍比稀释抗原抗体；电泳板打孔(6孔)，加入已稀释的抗原(约10 μL/孔)；电泳3~4h，电流：30mA/块，电压：100~120V；待火箭电泳结束，用0.1%氨基黑染色10min，7%醋酸脱色至条带清晰。

2．2．2 微量电泳法用移液管取煮沸的琼脂糖凝胶铺板（7.5×2.5cm)，共2块，每块约铺3ml凝胶(双扩同样方法，铺3块)；给微量电泳板打抗圆孔、抗体槽，并在抗原孔内分别加入阳性抗原和阴性抗原(约10μL)；电泳约40~60min ，(电压：4~6V/cm；电流：1~5mA/cm)；电泳结束后，取出抗体槽的凝胶，加入15 μL抗体，置37 ºC温箱过夜。

2．2．3 双向免疫扩散法铺2块板，同微量电泳；给双扩板打孔(梅花形)，每板打2组，一块板中央孔加入未稀释的抗原，每组周围6孔加入倍比稀释的抗体；置于37 ºC温箱孵育24~48hr，测定抗体效价；另一块板中央孔加入未稀释的抗原，每组周围6孔加入倍比稀释的抗体。

置于37 ºC温箱孵育24~48hr，测定抗原效价。

3 结果
3．1 火箭电泳法表：抗原浓度对应的电泳峰值（cm）
Ag(x) 1 0.5 0.25 0.125 0.06125 0.030625
峰值（cm) 1.75 1.55 1.4 1.35 1 0.87
3．2 微量电泳法实验结果表明，1/16抗原孔出现沉淀弧，说明了抗原在此浓度下与抗体反应最为敏感。

3．2 双向免疫扩散法实验结果表明靠阴性抗原处出现沉淀弧，表明了阴性抗原与抗体反应最为敏感。