磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达
赵忠润;包慧芳;王宁;周亚飞;杨慧;王炜
【摘要】[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli
BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27%的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.
【期刊名称】《新疆农业科学》
【年(卷),期】2010(047)012
【总页数】5页(P2505-2509)
【关键词】serC基因;pEC7;基因克隆;原核表达
【作者】赵忠润;包慧芳;王宁;周亚飞;杨慧;王炜
【作者单位】石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐,830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木
齐,830091;石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;新疆农业科微生物应用研究所,乌鲁木齐,830091
【正文语种】中文
【中图分类】S188+.2
0 引言
【研究意义】L-丝氨酸(L-Serine)化学名为2-氨基-3-羟基丙酸,是一种生糖氨基酸。

L-丝氨酸虽属于非必须氨基酸,但具有很多重要的生理功能和作用。

它可广泛应用
于食品、饲料、医药、农业及化妆品工业中,具有极其广阔的市场前景[1]。

但由于
技术原因,我国还不能大规模的生产L-丝氨酸。

【前人研究进展】目前,生产L-丝氨酸的方法主要有:蛋白质水解法、化学合成法以及微生物发酵法[2～4]。

由于蛋白
质水解法和化学合成法均具有较大缺点,因而这2种方法目前已不常使用。

而微生
物发酵法生产L-丝氨酸以其低成本,低污染,产品纯度高等优点备受人们的关注。

【本研究切入点】由于L-丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置,代谢运转速度极快,停留时间短[5]。

因此与其它氨基酸相比,L-丝氨酸的直接发酵法生产十分困难。

随着
生物技术的不断发展,通过基因重组技术选育出高产、优质、易于自动化生产的工
程菌已成为可能[6～8]。

【拟解决的关键问题】磷酸丝氨酸转氨酶(serC)是L-丝氨酸生物合成途径的关键酶之一,催化3-磷酸羟基丙酮酸生成3-磷酸丝氨酸。

研究进行磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆,并将其转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中,
探索其能否正常表达,为下一步丝氨酸高产基因工程菌的构建奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株JM109,DH5α,BL21(DE3),大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7均由新疆农业科学院微生物应用研究所保存;克隆载体
pMD19-T vector购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2 试剂
限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ和SacⅠ,T4DNA连接酶,Ex Taq,DL 5
000DNAMarker,Agarose D-1 LE购自宝生物工程(大连)有限公司;1kb DNAMarker,IPTG,X-gal,ProteinMolecular Weight Marker购自上海生工生物技术有限公司;胶回收试剂盒购自于上海华舜生物工程公司;测序由宝生物工程(大连)有限公司完成;引物由invitrongen公司合成;其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法
1.2.1 模板基因组的制备
对实验室保存的大肠杆菌JM109进行划线培养,挑取单菌落接种至20 mL LB液体培养基中培养过夜,收集菌体提取基因组DNA[9]。

1.2.2 目的基因克隆及鉴定
参照Genbank所公布的serC基因的碱基序列(D90728),采用Primer 5.0软件分析设计特异性引物,上游引物(serC1):5'-GGAGCTCATGGCTCAAATCTTCAATTT-3',下游引物(serC2):5'-GGATCCTTAGCCGTGAC GGCGTTC-3',分别在上下游引物两端引入SacⅠ和BamHⅠ酶切位点。

以JM109基因组DNA为模板,以serC1、serC2为引物,进行PCR扩增,阴性对照以等量无菌水作为模板。

PCR反应条
件:94℃,5 min;94℃1 min,65℃30 s,72℃70 s,30 cycles;72℃7 min。

PCR完毕,以0.8%琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增产物检测,并回收目的条带,连接至pMD19-T载体,命名为serC-T挑选经初步鉴定为阳性的克隆,提取质粒[10],送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序、分析。

1.2.3 重组表达载体的构建
提取经上述分析为阳性的serC-T质粒,采用SacⅠ和BamHⅠ酶切,回收1.1 kb条带连接至pEC7经SacⅠ和BamHⅠ酶切所得片段上,获得重组表达载体,命名为pEC7-C。

提取pEC7-C质粒,采用HindⅢ进行酶切鉴定,同时以质粒pEC7-C为模板,以serC1、serC2为引物,进行PCR扩增、鉴定。

1.2.4 重组蛋白的诱导表达和检测
选取经鉴定为阳性的pEC7-C重组质粒转化E.coli BL21,同时以空质粒pEC7转化E.coli BL21作为对照。

挑取单菌落接种至含有100 μ g/mL氯霉素(Chl)的LB液
体培养基中,37℃、200 r/min振荡培养过夜。

次日以1%接种量转接至含氯霉素(Chl)的液体LB培养基中,37℃培养至菌体光密度值OD600为0.6～0.8时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导培养5 h后收集菌体,采用超声波破碎,12 000
r/min离心超声后的裂解液5 min,沉淀中加入60 μ L 10 mmol Tris·Cl(pH 8.0)重悬。

取15 μ L与2×上样缓冲液混合,沸水中煮沸10 min,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电
泳进行检测,考马斯亮蓝染色。

2 结果与分析
2.1 目的基因的克隆及鉴定
2.1.1 serC基因的PCR扩增
以提取的大肠杆菌JM109基因组DNA为模板进行PCR扩增,对扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳结果表明,1 100 bp处可见一目的条带,与理论片段大小
一致。

图1
图1 serC基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of serC gene PCR products
2.1.2 阳性克隆的酶切鉴定和测序
挑取单菌落增菌培养后提取质粒,用限制性内切酶HindⅢ进行酶切鉴定,酶切完毕
进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,得到1条3 800 bp左右的基因片段,说明目的基因
已成功克隆至pMD19-T载体中。

测序结果表明,克隆得到的磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因片段大小为1 089 bp,含有完整的开放阅读框。

采用Blast软件分析,其与已发表的磷酸丝氨酸转氨酶基因核苷酸序列同源性为99.27%,表明克隆得到的序列为编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因序列。

图2
图2 重组质粒serC-T酶切电泳鉴定Fig.2 Electrophoretic delection of recombinant plasmid serC-T enzymatic digestion
2.2 重组表达载体的构建及结果鉴定
采用1.2.3方法进行重组表达载体的构建,并采用PCR和酶切方法鉴定重组表达载体。

酶切获得1条8 300 bp左右的基因片段,PCR获得1条1 100 bp的目的片段,与理论值相符。

图3
图3 重组表达载体pEC7-C酶切和PCR鉴定结果Fig.3 Detection results of recombination expression vehicle pEC7-C enzymatic digestion and PCR 2.3 磷酸丝氨酸转氨酶在大肠杆菌中的诱导表达
SDS-PAGE结果显示,41 kD处有目的蛋白条带。

说明磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在 E.coli BL21中能正常表达,且其表达量明显高于pEC7转化的E.coli BL21。

图4
图4 SDS-PAGE分析重组蛋白表达Fig.4 SDS-PAGE analysis of expression of the recombinant protein
3 结论
实验结果显示,通过基因克隆方法,以JM109基因组DNA为模板PCR扩增serC基因,将目的基因亚克隆至pMD19-T Vector上,经过酶切和PCR鉴定,证明所克隆的基因与预期大小一致,通过序列测定分析发现,所克隆的目的基因序列与已发表的磷酸丝氨酸转氨酶基因序列同源性为99.27%。

进一步将目的基因克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达质粒pEC7中,构建重组表达载体pEC7-C,转化E.coil BL21,经
过酶切和PCR方法鉴定,筛选阳性克隆。

经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导5 h 后,通过SDS-PAGE分析,蛋白在E.coil BL21进行了表达,表达量明显高于含有空载的菌株。

4 讨论
目前,通过基因工程方法系统的改变氨基酸生物合成过程中的某些步骤或途径来高效地提高产物产量的研究一直是氨基酸生产领域关注的重点,在其它氨基酸生产中,以大肠杆菌为主的基因工程技术应用已初见成效。

而通过基因工程菌生产L-丝氨酸还只停留在研究阶段,研究结果表明,构建的重组表达载体pEC7-C在大肠杆菌中能稳定表达,这将为筛选稳定、高效的L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了理论基础。

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