蛋白酶活性电泳实验

蛋白酶活性电泳
活性电泳(明胶酶谱法)
一、实验原理
明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。

通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。

通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。

二、材料与方法
1试剂与溶液配制
1.1试剂和仪器：
酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。

水为去离子水或超纯水。

主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制
1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液
配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。

使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。

1.2.2 明胶储液（10 mg/ml）
配法：称取明胶0.1 g，加去离子水10 ml，溶解，配好后储存于4℃。

若凝固成胶冻状可用温水浴解冻。

1.2.3 10 %过硫酸铵（W/V）
配法：称取1g过硫酸铵；加入10ml的去离子水，将固体粉末彻底溶解；贮存于4℃。

注意：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存可使用2周左右，过期会凝胶效果会减弱，可适当增加用量。

1.2.4 凝胶配制：
1) 10% SDS-PAGE凝胶之分离胶（含1.0 mg/ml 明胶）
dH2O 3ml
30%丙烯酰胺溶液 3.3 ml
4×分离胶缓冲液 2.5 ml
10%过硫酸铵0.1 ml
TEMED 0.004 ml
10 mg/ml明胶 1 ml
Total 10 ml
2)5%浓缩胶的配置
dH2O 4.56 ml
30%丙烯酰胺溶液 1.36 ml
4×浓缩胶缓冲液 2.0 ml
10%过硫酸铵0.1 ml
TEMED 0.008 ml
10 mg/ml明胶0 ml
Total 8 ml
3) 配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶轻溶液（5%）
dH2O 7.25 ml
30%丙烯酰胺溶液 2.50 ml
4×分离胶缓冲液 3.75ml
10%过硫酸铵0.1 ml
TEMED 0.008 ml
10 mg/ml明胶 1.5 ml
Total 15 ml
4) 配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶重溶液
15% 20%
dH2O 1.0 ml 0
30%丙烯酰胺溶液7.50 ml 10.0
4×分离胶缓冲液 3.75ml 3.75ml
10%过硫酸铵0.1 ml 0.1 ml
TEMED 0.01 ml 0.01 ml
10 mg/ml明胶 1.5 ml 1.5 ml
Total 15 ml 15 ml
重溶液添加蔗糖至0.1g/ml，增加溶液密度。

1.2.5洗脱液（1×）
配法：量取Triton X-100 25 ml，加去离子水定容至1000 ml即可。

1.2.6孵育液（1×）
配法：
1)中性孵育液：称取 Tris碱6.06 g，CaCl2·2H2O 0.74 g（或CaCl2 0.555 g），Brij-35 0.2 g，NaCl 11.7 g；加水至800 ml；用浓HCl调pH至7.6；定容至1000 ml。

2)弱酸性孵育液40g NaCH3COOH·3H2O溶于适量水，6mol CH3COOH 168mL，CaCl2·2H2O 0.74 g（或CaCl2 0.555 g），Brij-35 0.2 g，NaCl 11.7 g，加水至800，用冰乙酸调pH至4.0，定容，1000mL。

1.2.7 0.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250(400 ml)
配法：称取2 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取100 ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入40 ml冰醋酸，搅拌均匀；加入260 ml去离子水，搅拌溶解；用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。

1.2.8 考马斯亮蓝脱色液（400ml）
配法：甲醇：乙酸：水=5：1：4 。

2 实验方法
2.1蛋白酶样品制备
样品液前处理：发酵液10000g 离心，上清液经3kD超滤管6500 rpm浓缩，得到粗酶液，﹣20℃保存。

2.2 样品液蛋白酶活性的测定（福林一酚试剂法）
2.2.1 标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2 mol/L盐酸溶解，用50mmol/L的Tris-HCl (pH9.0) 缓冲液定容至100 mL，分别配成0-100
μgm/L的不同浓度的溶液。

不同浓度酪氨酸溶液各取lmL，加2%酪素l mL，于50℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸(TCA) 2 mL，离心，取上清液l mL，加入0.4mol/L的碳酸钠5 mL，再加入福林试剂l mL，于37℃水浴中显色15分钟，在680 nm波长比色，测光密度(O.D)。

以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.2 样品测定：取适当稀释的酶液l mL，加入2%酪素l mL，以下操作同上，同时作对照管。

2.2.3 酶活定义：在50℃，pH9.0的条件下每分钟水解酪蛋白产生l μg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

样品中含蛋白酶活力单位=A×F/15。

式中：A为由样品测定的光密度值查曲线得到的相当于酪氨酸的微克数，F为酶液最终稀释倍数，15为反应时间(分钟)。

2.2.4 调整样品液的浓度，计算出凝胶电泳所需酶量（约200U），若样品液比活不够高，须进一步浓缩以提高样品比活，或适当提高加样量。

2.3 活性胶操作步骤（gelatin zymogram）
2.3.1 配胶
梯度胶配制：灌制梯度胶与线性胶最大的区别在于需要使用梯度生成装置。

高浓度丙烯酰胺溶液内加入蔗糖可以稳定梯度的形成。

操作步骤：
1）准备好凝胶模具，并装配好梯度混合器，下置磁力搅拌器，混合槽内放入小转子，调整流速约为5ml/min(可使用蠕动泵)。

2）准备好未加TEMED的轻重分离胶溶液，灌制1mm厚的小板胶约需要轻重溶液各4ml，灌制1mm厚的大板胶约需要轻重溶液各15-18ml，倒入混合器前加入TEMED并混匀。

3）关闭梯度混合器的输出阀和两液槽间的连通阀，在贮液槽中加入定量的凝胶轻溶液，短暂打开连通阀，让少量轻溶液通过阀门流入混合槽中以除去阀门内气泡，防止堵塞。

4）在混合槽中加入等量凝胶重溶液，完全打开连通阀，开启磁力搅拌器，调整转速至混合槽内液体稍起漩涡，并固定转速，制相同凝胶使用固定转速以保证制胶的重复性。

5）打开连通阀，输出管头从胶板夹层顶部加入凝胶液体，吸头对着夹层一面，使液体只沿一块玻璃板留下。

当最后轻溶液流入输出管时，要注意，调整流速，确保最后几毫升轻溶液不致过快流入凝胶夹层影响梯度形成。

6）梯度胶顶部用1ml枪缓慢加入少量水，让凝胶聚合约1h充分聚合。

7）灌制浓缩胶，准备样品，加样进行电泳。

注意：一次可同时跑两板胶，配胶时一板为添加明胶的活性胶，一板为无明胶的普通胶，配胶过程尽量一致，普通胶做对照。

2.3.2上样，样品与非还原性上样缓冲液混合，室温静置10 min，不能加热。

2.3.3 同常规电泳，电泳槽冰浴，电压100-200 V，标记跑至距凝胶底部1-2cm时结束。

2.4 活性胶的处理
2.4.1 直接酶谱法
1) 活性胶孵育最适pH
制备活性胶A 2板（含明胶），浓度梯度为5%-20%，电泳结束后，洗脱，漂洗；漂洗完毕后，凝胶置于不同pH的孵育液中50℃孵育3h；考马斯亮蓝R-250 染色1h，脱色液脱色过夜。

2）活性胶孵育最佳时间
制备活性胶A 2板（含明胶），电泳洗脱漂洗同上，孵育时将胶条置于已确定的最适pH孵育液内，分别孵育1h、3h、6h、12h。

孵育完毕后操作同上。

3）蛋白酶电泳后位置的标定
制备活性胶A 1板，B 1板，C 1板；电泳洗脱漂洗同上；A胶于最适pH孵育液孵育最佳时间后染色脱色；B胶浸泡2%酪蛋白溶液2h，孵育同A胶，染色脱色；C胶电泳结束后，切下一条泳道，直接染色脱色，其余不作处理，４摄氏度保存。

根据A B胶亮带位置，对比各蛋白酶亮带位置；比较B亮带位置与C胶蛋白条带进行对比，确定ＡＢ胶亮带对应的蛋白酶在Ｃ胶中的大概位置。

4）将Ｃ胶中亮带对应的位置附近几条蛋白条带分别切下，回收。

操作见表1。

表1 活性胶的处理
孵育完毕后，染色1h，过夜脱色。

三实验结果与讨论
3.1 活性胶孵育最适pH
由图1 看出pH8.5的条件下，凝胶中的酶与底物明胶反应生成的条带数量最多，亮度最大。

图1 不同pH孵育条件下明胶活性电泳的差异
泳道1、2、3分别为在pH4.0、7.0、8.5条件下孵育3小时的条带
3.2活性胶孵育最佳时间
由图2得出，在pH8.5条件下，随孵育时间延长条带数增多，孵育4h后，条带模糊。

相比较孵育3h效果最好，条带数最多且条带清晰。

图2 pH8.5 孵育不同时间下明胶活性电泳的差异
泳道1、2、3、4分别为在8.5条件下孵育1h、2 h、3 h、4 h的条带
A B
图3 A ：粗酶液非变性SDS-PAGE 结果 B ：粗酶液非变性SDS-PAGE 复性浸泡酪蛋白孵育结果
3.3讨论
从明胶活性电泳结果可以看出，粗酶液中含有多种蛋白酶，但大部分条带亮度微弱，说明这些蛋白酶含量太低或活性较低。

泳道上方有多条亮度较大的条带，说明该位置可能存在几种活性较高的蛋白酶，且分子量较大，但从粗酶液非变性SDS-PAGE 结果（图3A ）看，对应位置上并无蛋白亮带，复性后浸泡酪蛋白孵育也无亮带。

References:
J E. 科林根等，精编蛋白质科学实验指南,
Dass, S. B. and C. G. Dosoretz, et al. (1995). "Extracellular proteases produced by the wood -degrading fungus Phanerochaete chrysosporium under ligninolytic and non-ligninolytic conditions." Archives of microbiology 163 (4): 254-258.
Liota, L.A. and W.G. Stetler-Stevenson (1990) Cancer Biology, 1, 96-106
Mitsuhashi, W. and A. Oaks (1994). "Development of endopeptidase activities in maize (Zea mays L.) endosperms." Plant physiology 104 (2): 401-407.
Morikawa, M. and Y. Izawa, et al. (1994). "Purification and characterization of a thermostable thiol protease from a newly isolated hyperthermophilic Pyrococcus sp." Applied and environmental
microbiology 60 (12): 4559-4566.。