油棕EgNAC 33基因的克隆与逆境响应表达分析

江西农业学报㊀２０２０，３２（６）：６ １０
ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＪｉａｎｇｘｉ
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ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｘｎｙｘｂ．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．１９３８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｘｎｙｘｂ．２０２０．０６．０２
油棕ＥｇＮＡＣ３３基因的克隆与逆境响应表达分析
周丽霞，曹红星∗
㊀
㊀收稿日期：２０１９－１２－１８
基金项目：农业农村部物种品种资源保护费项目（１２５１６３０１５０００１６０００４）；热带木本油料产业技术创新团队项目（１７ＣＸＴＤ－１３）；农业
农村部农业国际交流与合作项目（ＳＹＺ２０１９－１２）㊂
作者简介：周丽霞（１９８２─），女，山东聊城人，助理研究员，硕士，从事生物化学与分子生物学研究㊂∗通信作者：曹红星㊂
（中国热带农业科学院椰子研究所／海南省热带油料作物生物学重点实验室，海南文昌５７１３３９）
摘㊀要：应用ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术，克隆了油棕抗逆相关基因ＥｇＮＡＣ３３的全长ｃＤＮＡ；应用生物信息学方
法对其氨基酸序列进行了分析，同时采用ｑＲＴ－ＰＣＲ分析了低温㊁干旱及高盐胁迫处理后ＥｇＮＡＣ３３的响应表达情况㊂结果表明：克隆获得的基因ＥｇＮＡＣ３３的ｃＤＮＡ全长为１９５２ｂｐ，含１个长约７３５ｂｐ的开放阅读框，编码２４５个氨基酸，该基因编码的蛋白与椰子ＮＡＣ蛋白的同源性最高；ＥｇＮＡＣ３３基因受低温及高盐胁迫的诱导，其中，在８ħ条件下胁迫８ｈ时的表达量最高，在高盐条件下胁迫２４ｈ时的表达量最高；但在干旱胁迫下，
ＥｇＮＡＣ３３的表达量基本上不受影响㊂
关键词：油棕；ＥｇＮＡＣ３３基因；生物信息学；逆境胁迫；表达分析
中图分类号：Ｓ５６４．６㊀文献标志码：Ａ㊀文章编号：１００１－８５８１（２０２０）０６－０００６－０５
ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＥｇＮＡＣ３３ａｎｄＩｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｕｎｄｅｒＳｔｒｅｓｓｉｎＯｉｌＰａｌｍ
ＺＨＯＵＬｉ－ｘｉａ，ＣＡＯＨｏｎｇ－ｘｉｎｇ∗
（ＣｏｃｏｎｕｔＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ／ＨａｉｎａｎＫｅｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＯｉｌＣｒｏｐｓ，Ｗｅｎｃｈａｎｇ５７１３３９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＥｇＮＡＣ３３ｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｏｉｌｐａｌｍｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲａｎｄＲＡＣＥｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｉｔｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｕｎｄｅｒｃｏｌｄ，ｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓ⁃ｓｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｑＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＥｇＮＡＣ３３ｗａｓ１９５２ｂｐｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ７３５ｂｐ．Ｉｔｅｎｃｏｄｅｄ２４５ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＥｇＮＡＣ３３ｐｒｏｔｅｉｎｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｃｏｃｏｎｕｔＮＡＣｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｈｅＥｇＮＡＣ３３ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｏｌｄａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｅｓ，ａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｌｅｖｅｌｕｎｄｅｒ８ħｆｏｒ８ｈａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｆｏｒ２４ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥｇＮＡＣ３３ｗａｓｎｏｔａｆｆｅｃｔｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｄｒｏｕｇｈｔ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｏｉｌｐａｌｍ；ＥｇＮＡＣ３３；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；Ｓｔｒｅｓｓ；Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
㊀㊀当植物受到低温㊁干旱及盐碱等非生物逆境胁迫时，细胞会发生一系列的基因调控，产生一系列的逆境响应机制来适应逆境［１］㊂转录因子在基因调控过程中起到效应基因开关的作用，常见的转录因子，如ＷＲＫＹ㊁ＡＰ２㊁ｂＺＩＰ及ＮＡＣ等［２－４］，都在植物逆境响应过程中发挥调控作用，其中，ＮＡＣ转录因子广泛参与植物对逆境的响应过程㊂ＮＡＣ转录因子的Ｎ端存在１个比较保守的ＮＡＣ结构域，其Ｃ端有１个转录调控结构域，当接收到逆境胁迫信号后，ＮＡＣ通过转录调控结构域来调控下游基因的表达［５］㊂
ＮＡＣ转录因子最初是从矮牵牛分生组织中分
离出来的［６］，当缺少该基因时，叶片无法正常发育㊂近年来，随着对ＮＡＣ转录因子调控功能的不断挖掘，发现ＮＡＣ在植物生长发育㊁代谢衰老㊁植物对抗生物及非生物胁迫等多方面都起到表达调控的作用，如Ｋｕｓａｎｏ等［７］研究发现ＮＡＣ在水稻根㊁茎和花的发育早期及水稻成熟韧皮部的维管束组织中均有所表达㊂Ｇｕｏ等［８］研究发现ＡｔＮＡＣ基因在衰老叶片中的表达量上调，且过表达的ＡｔＮＡＣ基因会加速叶片的衰老㊂Ｚｈａｎｇ等［９］发现当水稻受稻瘟菌侵染后，２８个ＯｓＮＡＣ基因的表达量上调，１９个ＯｓＮＡＣ基因的表达量下调㊂Ｏｃｈｉａｉ等［１０］在水稻中筛选出１个ＮＡＣ基因Ｂｏｒｏｎｅｘｃｅｓｓ
ｔｏｌｅｒａｎｔ１，该基因可以负调控水稻的耐硼毒性㊂Ｙｏｋｏｔａｎｉ［１１］发现水稻中至少有５个ＮＡＣ基因在干旱及盐胁迫中的表达量上调，ＳＮＡＣ１基因的过量表达会促进水稻叶片气孔的关闭，减少水分流失，提高抗旱能力㊂Ｘｕｅ等［１２］通过转基因克隆小麦的ＴａＮＡＣ基因，发现该基因在干旱和低温胁迫下的表达量上调，以提高小麦对环境的抗逆性㊂孙丽娟等［１３］通过分析巨桉的基因ＥｇｒＮＡＣ１在低温㊁干旱和高盐胁迫下的表达量，发现该基因在上述３种非生物胁迫下的表达量均上调，该基因对这３种胁迫均会产生响应㊂
我国从马来西亚㊁印度尼西亚等油棕传统种植区引进油棕试种近９０年，主要种植在海南㊁广西等热区㊂近年来，随着棕榈油消费量的增大，油棕的种植面积急需扩大，但我国冬季的低温天气严重限制了油棕的扩大种植，低温是限制我国油棕产业发展的瓶颈之一，研究油棕ＥｇＮＡＣ３３基因的表达特征和功能，对油棕的抗逆尤其是抗寒育种具有重要意义㊂目前，关于油棕ＮＡＣ基因受非生物胁迫诱导表达的研究鲜有报道㊂笔者借助分子技术，克隆了油棕的ＥｇＮＡＣ３３基因，应用生物信息学方法分析了其序列结构特征，通过荧光定量ＰＣＲ方法检测了该基因在低温条件下被诱导表达的规律，同时初步探索了此基因对干旱及高盐胁迫的响应，旨在为进一步的基因功能鉴定工作提供试验依据，同时为油棕分子辅助育种提供候选基因㊂１㊀材料与方法
１．１㊀试验材料
供试油棕材料来自中国热带农业科学院椰子研究所油棕品种试种示范园㊂选取９株同一批培育㊁植株大小相近，长势良好㊁茎高约４５ｃｍ的幼苗，将其分为３个重复，每个重复为３株，放入可控植物三色光培养箱中，进行８ħ低温（光照１４ｈ／黑暗１０ｈ）处理，分别在处理后１㊁４㊁８㊁２４和４８ｈ时进行叶片采样；以２８ħ室外生长条件下的幼苗为对照组㊂分别用７㊁５㊁３㊁２和１ｄ不浇水的植株作为干旱处理组；以正常浇水组为对照组，进行叶片采样㊂高盐处理：将油棕幼苗置于不同塑料容器内，处理组容器中保持植株栽培盆１／２高度的３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，对照组则用清水保持同样液面高度，并分别在处理后０㊁４㊁１２㊁２４㊁４８及７２ｈ时进行叶片采样㊂取样样品均为幼苗的中间嫩叶，用液氮冷冻，用于ＲＮＡ的提取㊂
主要试剂：大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ５α为湖南大学分子育种实验室保存；Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁Ｔａｑ
ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ㊁ＲＮＡ逆转录试剂盒购自海口琼山莱客（海南）科技服务中心；克隆载体ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒㊁ＲＡＣＥ试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；荧光定量试剂盒［ＦａｓｔＳｔａｒｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）］购自罗氏公司；引物合成及测序由深圳华大基因科技服务有限公司完成㊂
主要仪器设备：Ｍｘ３０００Ｐ型实时荧光定量ＰＣＲ仪㊁ＳＹＮＧＥＮＥＧＢＯＸＨＲ凝胶成像分析系统㊁三色光培养箱（ＬＥＤ－３０ＨＬ１，美国）㊁超速冷冻离心机（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８１０Ｒ型，德国）㊁超微量核酸蛋白检测仪（ＴｈｅｒｍｏＮａｎｏｄｒｏｐ２０００）㊂１．２㊀ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成
采用Ｔｒｉｚｏｌ法［１４］提取油棕嫩叶的ＲＮＡ㊂称取约２ｇ油棕嫩叶，利用液氮将其研磨至粉末状，置于２ｍＬＥＰ离心管中，向管中加入１ｍＬＲＮＡ提取液，充分振荡并静置１０ｍｉｎ；再向其中加入０．２ｍＬ氯仿，充分振荡混匀后静置７ｍｉｎ；然后在４ħ超速冷冻离心机中以１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；吸取６００μＬ上清液至新的１．５ｍＬ无ＲＮａｓｅ的离心管中，加入等体积冰冻的异丙醇，轻轻摇匀后冰上放置１０ｍｉｎ，在４ħ超速冷冻离心机上以１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；去上清，加入１ｍＬ７５％乙醇，在４ħ超速冷冻离心机上以８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；去上清，在超净工作台上静置至酒精完全挥发，加入２０μＬＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水，用枪头吹打混匀得ＲＮＡ㊂用１％琼脂糖凝胶电泳检测所提取ＲＮＡ的完整性，利用超微量核酸蛋白检测仪检测ＲＮＡ的纯度及浓度㊂取１μＬ上述检测过的质量和纯度较好的ＲＮＡ，应用海口琼山莱客（海南）科技服务中心的ＲＮＡ逆转录试剂盒进行ｃＤＮＡ合成㊂
１．３㊀ＥｇＮＡＣ３３基因的克隆和序列分析
首先，从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中获得ＮＡＣ基因的编码序列，通过ＣｌｕｓｔａｌＸ进行多序列比对，根据序列的保守性设计兼并性引物ＮＡＣ－Ｆ：５ᶄ－ＧＧＡ⁃ＣＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＴＴＡＡＴＧＣ－３ᶄ；ＮＡＣ－Ｒ：５ᶄ－ＣＡ⁃ＣＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＣ－３ᶄ㊂以ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，利用获得的片段以Ｔ载体法克隆ＰＣＲ产物，将阳性克隆送深圳华大基因科技服务有限公司进行测序㊂
７
㊀６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀周丽霞等：油棕ＥｇＮＡＣ３３基因的克隆与逆境响应表达分析
根据ＲＴ－ＰＣＲ片段的序列测定结果，合成ＲＡＣＥ－ＰＣＲ所需的特异引物ＧＳＰ１：５ᶄ－ＣＴＧ⁃ＧＴＴＴＣＣＧＴＴＴＣＣＡＴＣＣＣ－３ᶄ；ＧＳＰ２：５ᶄ－ＣＧＡＡＣ⁃ＣＧＡＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡ－３ᶄ，分别用于克隆ｃＤＮＡ的５ᶄ端序列和３ᶄ端序列，具体步骤均按ＲＡＣＥ试剂盒说明书执行；ＰＣＲ产物回收后经Ｔ载体克隆㊁测序，并与已克隆的ＮＡＣ基因编码拼接，从而获得全长ｃＤＮＡ序列㊂以拼接得到的基因全长ｃＤＮＡ设计引物ＮＡＣ－Ｆ：５ᶄ－ＣＴＣＡＡＡＧＡＴＴＡＧＡＧＧＣＴＣＣＣＣ－３ᶄ；ＮＡＣ－Ｒ：５ᶄ－ＡＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＧＴ－３ᶄ，通过ＰＣＲ扩增和测序，验证所获基因全长的准确性㊂
１．４㊀ＥｇＮＡＣ３３基因的表达分析
应用实时荧光定量ＰＣＲ考察ＥｇＮＡＣ３３基因在油棕叶片中的表达量变化情况，以Ａｃｔｉｎ１为内参基因，引物为Ａｃｔｉｎ１－Ｆ：５ᶄ－ＧＴＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＣＧ－３ᶄ；Ａｃｔｉｎ１－Ｒ：５ᶄ－ＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡ－３ᶄ［１５］㊂应用Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计ＥｇＮＡＣ３３基因的定量引物ＥｇＮＡＣ３３－Ｆ：５ᶄ－ＡＣＧＣＴＴＴＣＣＧＣＧＡＣＡＣＴＧ－３ᶄ；ＥｇＮＡＣ３３－Ｒ：５ᶄ－ＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＧＴＧＡＡＣＡＡ－３ᶄ㊂定量ＰＣＲ分别进行３个生物学重复和３个技术重复，反应体系为１０μＬ：５μＬＦａｓｔＳｔａｒｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ缓冲液㊁０．５μＬ上引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）㊁０．５μＬ下引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）㊁０．２μＬＲｏｘ㊁１μＬｃＤＮＡ模板㊁２．８μＬｄｄＨ２Ｏ㊂反应条件为：９５ħ预变性１０ｍｉｎ；９５ħ变性１５ｓ，６０ħ复性３０ｓ，７２ħ延伸２０ｓ，共３５个循环㊂
１．５㊀数据分析
应用ＳＭＡＲＴ软件预测ＥｇＮＡＣ３３的保守结构域；通过ＮＣＢＩ网站ｂｌａｓｔ油棕ＥｇＮＡＣ３３与其他植物ＮＡＣ蛋白序列的同源性；同时应用ＭＥＧＡ６．０６软件构建油棕与其他植物ＮＡＣ蛋白的进化树，分析进化关系㊂
２㊀结果与分析
２．１㊀ＥｇＮＡＣ３３基因的克隆与测序分析
在ＲＡＣＥ后通过拼接㊁验证和再测序，获得了１条ＮＡＣ的全长ｃＤＮＡ序列，该序列大小约为１９５２ｂｐ，含１个长约７３５ｂｐ的开放阅读框，可编码２４５个氨基酸残基㊂在ＮＣＢＩ网站上ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）对比后，发现该基因靠近Ｎ端的位置具有ＮＡＣ保守结构域㊂将ＥｇＮＡＣ３３基因编码的蛋白序列与其他植物的同源蛋白序列进行比对，结果如图１所示，在不同植物间蛋白序列Ｎ端约１１个氨基酸的同源性较低，第４７ １４３氨基酸序列相对保守㊂通过分析不同植物间ＮＡＣ基因的系统进化树（图２），发现大致分为２个亚族，其中油棕ＮＡＣ３３与ＣｎＮＡＣ同源蛋白的亲缘关系最近，其同源氨基酸相似度高达９３％，且与椰枣和槟榔同属１个亚族，该亚族中的植物均为木本植物；而拟南芥㊁大豆和花生作为草本植物聚类在一起，与其他木本植物的亲缘关系较远㊂在进化上，ＥｇＮＡＣ３３与ＣｎＮＡＣ的亲缘关系最近㊂
Ａｔ为拟南芥；Ｃｎ为椰子；Ｇｍ为大豆；Ｏｓ为水稻；Ｄｐ为椰枣；Ａｃ为槟榔㊂图１㊀油棕ＥｇＮＡＣ３３蛋白序列与其他植物同源蛋白序列的比对
２．２㊀在低温胁迫下ＥｇＮＡＣ３３基因的表达
由图３可知，油棕幼苗经过８ħ低温处理后，ＥｇＮＡＣ３３在各时间点的表达明显受到低温诱导，且在各低温胁迫时间点的相对表达量均比对照组的表达量高，显示该基因受到了低温胁迫的诱导㊂其中在低温胁迫的０ ８ｈ期间，ＥｇＮＡＣ３３的表达量逐渐变大，在８ｈ时其相对表达量达到最高水平；随着低温胁迫时间的增加，其表达量先降低，然后又增加；从整体上看，在８ħ低温条件下，ＥｇＮＡＣ３３的表达在不同处理时间下均被强烈诱导，与对照相比，该基因的表达量在１ｈ时即被诱导增加了４．４２倍，在４ｈ时增加了７．８３倍，在８ｈ
８江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３２卷
时增加了９．８８倍，在２４ｈ时增加了２．９１倍，在４８ｈ时增加了５．９８倍㊂由此可见，在不同的胁迫时间段内，ＥｇＮＡＣ３３基因的表达量存在一定的波动性㊂这说明ＥｇＮＡＣ３３基因参与了调控油棕的抗寒响应，但又体现了其对低温胁迫响应调控的复杂性，一方面该基因的表达与温度有关，另一方面，它还可能受到植物其他生理因子的影响［１６］㊂
图２㊀不同植物间ＮＡＣ基因的进化树分析
图３㊀在低温胁迫下ＥｇＮＡＣ３３基因的相对表达量２．３㊀在高盐胁迫下ＥｇＮＡＣ３３基因的表达
从图４可以看出：油棕幼苗经过３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液处理后，ＥｇＮＡＣ３３在各胁迫时间点的表达量明显受到高盐诱导，且在各胁迫时间点的相对表达量均高于对照组的表达量，初步表明该基因受到了高盐胁迫的诱导㊂具体来说，在胁迫的０ ２４ｈ期间，ＥｇＮＡＣ３３的表达量逐渐变大，其中，在２４ｈ时的相对表达量达到最高水平，高达４．３倍；随着胁迫时间的延长，其表达量逐渐降低㊂由此可见，ＥｇＮＡＣ３３基因对高盐胁迫做出了应答，参与了调控油棕的耐盐机制㊂
２．４㊀在干旱胁迫下ＥｇＮＡＣ３３基因的表达
从图５可以看出，在干旱胁迫条件下，在各时间点ＥｇＮＡＣ３３基因的相对表达量与对照组相比无明显差异㊂推测ＥｇＮＡＣ３３不能被干旱胁迫诱导，该基因不参与干旱逆境的应答信号途径㊂
３㊀讨论与结论
ＮＡＣ基因家族是植物特有的一类转录因子，在植物生长发育中具有重要的调控作用，而且也参与植物对干旱㊁高盐㊁低温等非生物胁迫的抗逆反应，其中有２０％ ２５％的家族成员参与至少１种以上逆境因子的响应［１７］㊂本研究通过分析ＥｇＮＡＣ３３蛋白的生物信息学特性，发现ＥｇＮＡＣ３３
基因的长度为１９５２ｂｐ，含有１个长约７３５ｂｐ的开放阅读框，编码２４５个氨基酸；ＥｇＮＡＣ３３蛋白质的Ｎ端具有ＮＡＣ保守结构域；在系统进化上，该基因与椰子ＮＡＣ的亲缘关系最近，且与椰枣和槟榔同属一个亚族㊂该结果表明棕榈科植物中ＮＡＣ蛋白的氨基酸序列具有高度的保守性㊂
图４㊀在高盐胁迫下ＥｇＮＡＣ３３基因的相对表达量
图５㊀在干旱胁迫下ＥｇＮＡＣ３３基因的相对表达量
９
㊀６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀周丽霞等：油棕ＥｇＮＡＣ３３基因的克隆与逆境响应表达分析
㊀㊀很多研究表明，ＮＡＣ基因受多种逆境因子的影响，并能启动多个逆境反应调控途径，参与植物的多种抗逆响应，例如：棉花的ＧｈＳＮＡＣ５和Ｇｈ⁃ＳＮＡＣ８基因会不同程度地被高盐㊁干旱及黄萎病胁迫诱导［１８］；番茄的ＴＮＡＣ基因同时受高盐和低温逆境的诱导［１９］；大豆的ＧｍＮＡＣ基因受盐胁迫的诱导［２１］㊂本研究发现，ＥｇＮＡＣ３３对干旱胁迫没有明显响应，但对低温和高盐胁迫均表现出典型的诱导表达效应，且在不同处理时间点均表现出诱导表达的特点，同时由ＥｇＮＡＣ３３介导的冷胁迫及高盐胁迫响应与干旱胁迫响应途径没有交叉反应㊂
基因的表达调控是一个复杂的过程㊂本研究只初步考察了油棕受到低温㊁高盐及干旱胁迫时ＥｇＮＡＣ３３基因的表达量变化，虽然可以为研究ＮＡＣ基因家族调控油棕抗逆反应机制提供一定的试验依据，但对该基因家族的具体表达调控机制及其在油棕对抗外界胁迫时发挥的具体作用还需更深入的探索㊂
参考文献：
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ｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｄｅｓｅｒｔｍｏｓｓＢｒｙｕｍａｒｇｅｎｔｅｕｍ［Ｊ］．
ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ，２０１８，１９（１１）：３６３７－３６５４．［５］ＤａｌｍａｎＫ，ＷｉｎｄＪＪ，Ｎｅｍｅｓｉｏ－ｇｏｒｒｉｚＭ，ｅｔａｌ．Ｏｖｅｒｅｘ⁃ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰａＮＡＣ０３，ａｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄＮＡＣｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎＮｏｒｗａｙｓｐｒｕｃｅｌｅａｄｓｔｏｒｅｄｕｃｅｄｆｌａ⁃ｖｏｎｏｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄａｂｅｒｒａｎｔｅｍｂｒｙｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２０１７，１７（１）：６－２３．［６］ＳｏｕｅｒＥ，ＶａｎＨＡ，ＫｌｏｏｓＤ．ＴｈｅｎｏａｐｉｃａｌｍｅｒｉｓｔｅｍｇｅｎｅｏｆＰｅｔｕｎｉａｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐａｔｔｅｒｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｅｍｂｒｙｏｓａｎｄｆｌｏｗｅｒｓａｎｄｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔｍｅｒｉｓｔｅｍａｎｄｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９７，８５（２）：１５９－１７０．［７］ＫｕｓａｎｏＨ，ＡｓａｎｏＴ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＯＮＡＣ３００，ａｎｏｖｅｌＮＡＣｇｅｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔ
ｅａｒｌｙｓｔａｇｅｓｉｎｖａｒｉｏｕｓｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｔｉｓｓｕｅｓｏｆｒｉｃｅ［Ｊ］．
ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｏｍｉｃｓ，２００５，２７２（３３）：６１６－６２６．［８］ＧｕｏＹＦ，ＧａｎＳＳ．ＡｔＮＡＰ，ａＮＡＣｆａｍｉｌｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ｈａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００６，４６：６０１－６１２．
［９］ＺｈａｎｇＸ，ＷｕＺ，ＸｉｅＬ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｔｗｏｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｒｉｃｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００８，１３９（２）：８２２－８３５．
［１０］ＯｃｈｉａｉＫ，ＳｈｉｍｉｚｕＡ，ＯｋｕｍｏｔｏＹ，ｅｔａｌ．ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａＮＡＣ－ｌｉｋｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｏｒｏｎ－
ｔｏｘｉｃｉｔｙｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１１，
１５６：１４５７－１４６３．
［１１］ＹｏｋｏｔａｎｉＮ，ＩｃｈｉｋａｗａＴ，ＫｏｎｄｏｕＹ．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｖａｒｉｏｕｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓｅｓｃｏｎｆｅｒｒｅｄｂｙｔｈｅｓａｌｔ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
ｒｉｃｅｇｅｎｅＯＮＡＣ０６３ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔａ，２００９，２２９（５）：１０６５－１０７５．
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－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｇｅｎｅｓａｎｄｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｂｒｅａｄ
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（责任编辑：黄荣华）
０１江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３２卷。