大豆耐盐基因定位及耐盐基因克隆研究进展解读

78 江苏农业科学 2010年第5期
陈华涛, 陈新, 喻德跃, 等. 大豆耐盐基因定位及耐盐基因克隆研究进展[J].江苏农业科学, 2010(5:78-80.
大豆耐盐基因定位及耐盐基因克隆研究进展
陈华涛
1, 2
, 陈新, 喻德跃, 顾和平, 张红梅, 袁星星
12111
(1. 江苏省农业科学院蔬菜研究所, 江苏南京210014; 2. 南京农业大学国家大豆改良中心, 江苏南京210095
摘要:土壤的盐渍化和次生盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要因素之一。

大豆作为油料作物和经济作
物, 在食品工业和农业生产中占重要地位。

大豆品种资源丰富, 不同品种间耐盐性差异较大, 使得培育耐盐高产等优良性状聚合的大豆品种成为可能。

相对于常规育种改良大豆的耐盐性, 分子标记辅助选择和转基因等新技术为我们改良大豆的耐盐能力提供了新途径。

本文综述了大豆耐盐基因定位及耐盐基因克隆的研究进展, 并探讨了分子标记辅助育种及转基因育种在大豆耐盐育种中的潜力和作用。

关键词:大豆; 耐盐性; 基因定位; 基因克隆
中图分类号:S565. 101 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2010 05-0078-03
土壤的盐渍化和次生盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要因素之一。

全世界至少有20%的耕地盐渍化。

在干旱和半干旱地区, 土壤次生盐渍化日趋严重。

我国约有盐渍
2
化和次生盐渍化土地4000万h m 以上, 成为制约农业发展的主要环境因素之一。

栽培大豆[G lycine max (L . M err . ]属于中等耐盐作物, 其土壤盐度阈值是5.
0ds/m。

灌溉水电导
[1]
率超过6. 7ds/m时, 植株就会死亡。

大豆品种间耐盐性存在差异。

据Abel 等的研究, 当土壤盐度从5. 0ds /m提高到10. 2ds/m时, 大豆植株的死亡率和叶片坏死均增加, 叶片出现缺绿, 茎秆重和籽实产量降低, 盐敏感品种与耐盐品种相比受到盐胁迫的影响更大。

选育耐盐品种是缓解土壤盐
[5]
渍化对农业生产影响的有效途径之一。

因此, 提高农作物的耐盐能力, 对于改善农业生产和扩大可耕地面积均具有重要的现实意义。

大豆作为油料作物和经济作物, 在食品工业和农业生产中占重要地位。

而且大豆品种资源丰富, 不同品种间耐盐性差异较大, 这使培育大豆耐盐高产等优良性状聚合的品种成为可能。

相对于常规育种改良大豆的耐盐性, 分子标记辅助选择和转基因等新技术为我们改良大豆的耐盐能力提供了新手段。

本文综述了大豆耐盐基因定位及耐盐基因克隆研究的进展, 并探讨了分子标记辅助育种及转基因育种在大豆耐盐育种中的潜力和作用。

1 大豆耐盐分子标记研究
自从1980年限制性片段长度多态性标记出现以来, DNA 分子标记有了较大的
发展。

目前最常用的分子标记主要有以下5种类型:RFLP(Restricti on fragm en t length pol ymorph is m, 限制性片段长度多态性、RAPD(Random -a m plifi ed pol ymor phic DNA, 随机扩增多态性, AFLP(Am plifi ed frag m ent length pol ymorph i s m, 扩增片段长度多态性, SSR (S m i p le sequence
收稿日期:2009-12-29
基金项目:国家转基因重大专项(编号:2008ZX08004-004; 江苏省高技术项目(编号:BG2006308; 江苏省农业科技自主创新资金[编号:cx(09 626-2 ]。

作者简介:陈华涛(1980 , 男, 河南周口人, 博士, 助理研究员, 从事大豆耐逆分子
遗传与育种研究。

E -m ai:l ch t @jaas . ac . cn 。

[4]
[2-3]
repea, t 简单重复序列多态性和S NP(S i ngl e nucleoti de pol y
m orph is m, 单核苷酸多态性。

分子标记技术的广泛应用为大豆耐盐遗传育种提供了有力的辅助工具。

Zhong 等使用改进的RAPD 方法即DAF (DNA amp lificati on fingerpri nting, 在耐盐品种Morgan 和文丰7中鉴定到3个特异的多态性位点, 即8. 6f/350bp 、8-27/
[6]
240bp 和8-15/215bp 。

郭蓓等以大豆耐盐品种和敏感品种以及耐盐品种文丰7! 敏感品种Union ∀组合的F 2群体为材料, 利用BS A 法对耐(敏盐品种池和一个组
合F 2的耐(敏盐池进行了鉴定, 获得一个共显性PCR 标记。

经F 2分析, 在盐敏感个体中仅扩增出约600bp 的特异片段, 在耐盐个体中扩增出约700bp 的特异片段或
2个特异片段(700bp /600bp 。

耐盐基因与分子标记连锁关系测定, 因未发现重组个体, 而判定该标记与大豆耐盐基因位点紧密连锁。

该标记已在其他2个组合(锦豆
33! H ark ; 铁丰8号! 早熟6号的F 2群体及12个耐盐品种和13个盐敏感品种中
得到验证。

张海燕等利用目前大豆中已经克隆的耐盐相关基因及ES T 序列, 设计
43对引物, 分别对大豆耐盐品种文丰7号和盐敏感品种Union 的基因组DNA 、RNA 进行检测, 开发了6
[9]
个可用于大豆种质耐盐性鉴定的标记。

2 大豆耐盐QTL 定位研究
遗传图谱是进行数量性状基因定位(QTL 的基础。

DNA 分子标记出现以后, 以其数量丰富、遗传稳定及操作简单等特性, 大大促进了大豆的遗传作图, 大豆遗传连锁图上的标记数从1987年的57个迅速增至为1999年的1423个。

从最早的大豆遗传图谱发表至今, 已经有37个遗传图谱登录在大豆数据库SoyBase(http ://soybase. agron . iastate . edu / 上。

1个是整合的USDA 连锁图谱(也称公共图谱, 1个为传统标记组成的连锁图谱, 另外35个为由不同群体构建的分子标记连锁图谱。

大豆耐盐QTL 定位研究刚刚开始。

Lee 等通过耐盐种质资源S-100与盐敏感种质资源杂交后代分离群体F 2#3的分析和鉴定, 在大豆N 连锁群上检测到1个苗期耐盐的主效
[10]
QTL, 定位在Satt237与Sat091标记之间。

随后作者用耐盐主效QTL 两侧的SSR 标记Satt 237和Sat091鉴定S 100衍, [8]
[7]
陈华涛等:大豆耐盐基因定位及耐盐基因克隆研究进展 79
盐性, 说明该标记可用于S-100后代耐盐性的分子标记辅助选择。

Chen 等采用一套大豆重组自交系群体(RIL 进行大豆苗期耐盐QTL 定位与分析, 在温室和滩涂2种环境下共检测到7个新的耐盐QTL , 其中在G 连锁群上定位到一个新的稳定的耐盐主效QTL(温室和滩涂2种环境下均能检测到, 位
[11]
于标记Sat164和Sat358之间。

值得一提的是Chen 等在
[11]
大豆N 连锁群上Satt237标记附近检测到一个耐盐QTL , 认为其与Lee 等定位的耐盐QTL 共位。

H a mw i eh 等利用盐敏感栽培大豆品种Jackson 和耐盐野生大豆J WS156-1的F 2群体定位耐盐QTL , 在大豆N 连锁群上定位到一个主效耐盐QTL, 并研究了此耐盐QTL 在野生大豆和栽培大豆中的保
[12]
守性。

通过定位大豆耐盐QTL, 首先可以获得与耐盐基因连锁的分子标记, 为进行大豆耐盐分子标记辅助选择提供标记资源。

其次, 可以对在多个环境下稳定表达的主效耐盐QTL 进行精细定位和图位克隆, 进而获得耐盐基因, 为利用转基因手段改良大豆耐盐能力提供基因资源。

3 大豆耐盐基因克隆研究
目前报道的大豆耐盐基因主要有LEA (Late-e m bryogen esi s-abundan t protei
n 、离子转运蛋白及其他耐盐相关基因。

兰英从开花后40~45d 大豆种子中扩增出6个大豆LEA 基因, 将其中3个基因的重组质粒分别转化大肠杆菌, 并将LEA1基因转化烟草植株, 将获得的重组子和转基因植物对高渗透胁迫耐受性进行深入研究[13]。

蔡丹等将大豆Em (LEA1 基因构建到原核表达载体pET28-Em 中, 转化大肠
杆菌, 表明大豆E m 蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性。

在此基础上, 构建了含Em 基因的真核表达载体pBI-E m, 再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草, 转Em 基因烟草植株在含有质量分数1. 5%NaC l 的培养基中生长状况好于对照植株, 叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片。

结果表明, 大豆Em 基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性。

刘昀等利用大肠杆菌异源表达体系证明了大豆P M 2蛋白(LE A3 的耐盐功能, 并首次证实P M 2蛋白序列中的22-氨基酸结构域(PM2B 为一主要耐盐结构域。

为在高等植物中进一步验证P M 2蛋白及22-氨基酸结构域的耐盐功能, 将大豆PM2及P M2B 基因克隆至植物表达载体pB I121, 并利用农杆菌侵染法转化烟草叶盘, 结果表明转P M2和P M2B 基因的烟草耐盐性明显高于对照(转化pB I121载体植株。

余玉雯等构建了大豆未成熟种子c D NA 文库, 利用大肠杆菌表达及功能筛选法, 从大豆c DNA 文库中筛选出若干个
耐盐相关基因片段, 对其中的GmAIP -2基因的耐盐功能进行了初步鉴定[16]。

李富鹏等利用RACE 技术从大豆中克隆出一条耐盐相关基因STL , 该基因全长为
1286bp , 其中编码区为717bp , 编码一个由238个氨基酸组成的蛋白质, STL 与拟南芥的耐盐蛋白S TO(salt tol erance pro
[17]
tei n 具有63. 6%的同源性。

Luo 等从大豆中克隆了一个Cation /proton转运蛋白基因GmCAX1, GmCAX1在大豆所有的组织中均有表达, 其中在根中的表达量相对较弱, 亚细胞定位结果显示GmCAX1被定位在质膜上, 过量表达GmCAX1后的[18]
[15]
[14]
[10]
Na /H转运蛋白基因GmNHX1, GmNHX1是位于液泡膜上的N a +/H +转运蛋白, GmNHX1能响应盐胁迫和干旱胁迫。

在盐胁迫下, 过量表达GmNHX1基因的转基因植株的液泡里
+
拥有较高的Na 浓度, 推测GmNHX1基因使植物细胞内的高浓度的Na 隔离在液泡里, 进而减轻高浓度的N a 对植株的毒害。

L i 等克隆了一个氯离子通道基因GmCLC1, 其功能和GmNHX1基因相似, 它能把植物细胞内过多的氯离子隔离在液泡里, 进而减轻高浓度的C l -对植株的毒害。

周国安等
++
克隆一个大豆Na /H 逆向转运蛋白的同源基因GmNHX2, 编码一条长534氨基酸的多肽并预测有10个可能的跨膜结
[20]
构域。

GmNHX2在大豆的根、茎和叶中表达, 但在根中的丰度最高, 能够响应N a C l 和PEG (polyethylene gl ycol 的诱导。

与野生型植株相比, 异源表达GmNHX2的拟南芥植株在
[20]
萌发和幼苗期都更加耐高浓度的NaC l 。

这些结果暗示, GmNHX2是一个N a +/H +逆向转运蛋白同源物, 可能在盐胁迫下执行调节离子内平衡的功能
[20]
[19]
+
+
++。

4 大豆分子标记辅助选择育种研究
国内的研究主要集中在对重要性状基因定位及获得与其连锁的分子标记[11, 21], 而国外却注重对已获得大豆重要性状分子标记的应用研究, 并取得了进展。

将野生大豆鉴定出的控制产量的QTL 转入6个不同遗传背景的栽培大豆中, 发现该QTL 在2个栽培大豆中有增产效果, 在不同的试
[25]
验环境可稳定增产9%。

Boer m a 等利用抗草甘膦转基因大豆品系为供体, 以大豆品种Ben i ng 为受体, 利用SSR 标记恢复轮回亲本Ben i ng 的基因组, 育成了抗草甘膦的品种Ben
[26]
ingRR, 极大地缩短了育种年限。

针对大豆耐盐分子标记辅助选择育种的研究, 目前尚处于获得与耐盐基因紧密连锁
[10-12]
的分子标记阶段, 在获得了足够多且可靠的耐盐分子标记之后, 便可以进行大豆耐盐分子标记辅助选择育种。

5 大豆转基因育种研究
大豆常用的转基因方法有花粉管通道、农杆菌介导、基因枪及PEG 等方法。

国内转基因大豆的研究大部分是对转基因植株进行了抗性标记筛选、PCR 阳性检测和Southern b l ot 杂交分析拷贝数, 仅证明了外源基因已经整合到大豆的基因[27-28]组。

与国外的转基因大豆研究相比, 中国缺少原创性的表达载体和具有重大应用前景的关键基因, 而且转基因效率尚待提高。

国外大豆转基因方法多为农杆菌介导法和基因枪法。

1988年H inchee 等首次利用农杆菌介导法获得了转基因大豆植株; 1989年Parrott 等采用基因枪法获得了转基因
[30]
大豆植株。

遗传转化的外源基因覆盖了抗虫、抗除草剂及品质改良等方面。

并且在优化组织再生条件及提高遗传转化效率、去除选择标记等方面获得了突破性的进展。

转基因大豆产业化引领了世界转基因作物的快速发展, 美国M onsan t o 公司利用基因枪轰击方法将编码5-烯醇-丙酮酸莽草酸-磷酸合成酶(EPSPS 基因导入大豆, 育成Roundup Ready 转基因大豆, 得到大面积的推广种植并形成产业化。

2008年, 美国和阿根廷的转基因大豆种植面积达90%以上, 巴西的转基因大豆种植面积近65%。

由此可见, 转基因技术[31]
[32]
[29]
[10, 12-24]。

i [19]
80 江苏农业科学 2010年第5期
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+
豆品种提供了一个行之有效的手段。

6 展望
植物的耐盐性状是一个多基因控制的数量性状, 而且很多与耐盐相关的基因未被发现, 这就决定了植物耐盐机制的
复杂性。

一方面, 通过获得与大豆耐盐基因紧密连锁的分子标记, 进行分子标记辅助选择育种, 加速培养耐盐大豆的步伐; 另一方面, 随着耐盐相关基因的克隆, 为通过基因工程的手段改良大豆的耐盐性提供了基础。

为了图位克隆耐盐QTL 基因,
首先要有高密度的分子图谱, 其次, 寻找QTL 附近的分子标记对耐盐性状进行精细定位。

然后用紧密连锁的标记去筛选BAC 库以获取最终的目的基因。

目前, 大豆耐盐相关的QTL 定位工作刚刚起步, 因此, 大豆更多的耐盐QTL 需要采用不同的群体、定位指标及方法等发掘出来。

需要指出的是, 大豆基因组测序工作的完成为图位克隆大豆耐盐QTL 提供了基础。

在大豆耐盐分子标记辅助育种中, 在重视单个基因位点作用的基础上, 还应对基因与基因之间的互作、基因与环境之间的互作等加以考虑; 在育种辅助选择中所使用标记的准确性及可靠性方面, 应采用不同的研究材料对同一定位区间进行验证性的研究。

转基因育种则正由单基因向多基因的转化转变, 同时, 提高转化效率、定点整合、无筛选标记基因和规模化筛选等也是转基因研究的热点。

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