用16SrDNA方法鉴定细菌种属

用16S rDNA 方法鉴定细菌种属
一、实验目的
1。

掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；
2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。

二、实验原理
细菌rRNA(核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。

16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法.
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟,其种类少,含量大(约占细菌RNA 含量的80％)，分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称.在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。

16S rDNA 由于大小适中，约1。

5Kb 左右,既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌,其技术路线如下：
细菌基因组的提取：
PCR 的基本原理 :
PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。

PCR 由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离,使之成为单链，以便它与引物结合,为下轮反应作准备；
②模板DNA 与引物的退火（复性):模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料,靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

二、操作步骤
1、细菌基因组DNA提取；
2、PCR扩增；
3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；
4、扩增片段回收；
5、DNA片段测序。

三、结果处理与分析
在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，
放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1。

02g，放入回收的凝胶后为1.42g,,则凝胶为400mg，
因此加入的Binding Buffer为1200μl。

我们小组选用B1 16S sequence,以下为制作进化树过程:
1、根据B1 16S 基因序列，到NCBI 上比对，确定其种属
（1）NCBI 主页（http：//www.ncbi。

nlm。

nih。

gov/）依次点击进入BLAST
（2）选择nucleotide BLAST
（3）将B1 序列复制到文本，框里Choose Search Set 处点复选按钮others，最后点BLAST
（4）点击BLAST后，数据进行提交.BLAST 结果如下：
图中“Evalue”指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totle score)都是数值越高相似度越高。

我组将数据按照Query cover从100％开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。

（5）导出数据
数据导出格式选择FASTA：
（6）选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌
（7）下载MEG并安装，我组使用的是MEGA5.02，并将B1序列导入MEG
（8）通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中（9）选择W 中Align DNA，然后点击OK。