HPLC-UV法测定黄芪干燥根中黄芪甲苷的含量

HPLC-UV法测定黄芪干燥根中黄芪甲苷的含量
姜丽丽;张传领;苏丽娟;王秀娟;牛丽丽;温建勋
【摘要】[目的]建立黄芪干根中HPLC-UV法测定黄芪甲苷的方法,同时比较蒙古黄芪、野生黄芪和膜荚黄芪3种不同来源样本的黄芪甲苷含量.[方法]采用HPLC-UV法,色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6mm),流动相为乙腈∶水(32∶68),流速1.0 ml/min,检测波长203 nm.[结果]黄芪甲苷在0.05 ～0.50 mg/ml范围内线性关系良好(r=0.999),平均回收率为98.216％(RSD=2.85％);不同来源黄芪甲苷含量比较结果为野生＞膜荚≈蒙古.[结论]建立的HPLC-UV法测定黄芪甲苷含量相对稳定,方法简便,为今后黄芪干根中黄芪甲苷含量的测定提供了方法参考.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2014(000)022
【总页数】3页(P7381-7383)
【关键词】HPLC-UV;黄芪甲苷;含量;干燥根
【作者】姜丽丽;张传领;苏丽娟;王秀娟;牛丽丽;温建勋
【作者单位】内蒙古医科大学分子病理学实验室,内蒙古呼和浩特010059;内蒙古医科大学药学院,内蒙古呼和浩特010059;内蒙古医科大学法医鉴定中心,内蒙古呼和浩特010059;内蒙古医科大学分子病理学实验室,内蒙古呼和浩特010059;内蒙古医科大学分子病理学实验室,内蒙古呼和浩特010059;内蒙古医科大学分子病理学实验室,内蒙古呼和浩特010059
【正文语种】中文
【中图分类】S567
黄芪为常用的中药材之一，始载于《神农本草经》，我国历版药典均有收载。

黄芪是豆科植物蒙古黄芪［Astragalus
membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］或膜荚黄芪［Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.］的干燥根，味甘性微温，具有补气固表、利尿脱毒、排脓、敛疮生肌之功效［1］。

黄芪中主要成分为皂苷类、黄酮类、多糖类等，其中的黄芪甲苷是黄芪药材中的重要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、清除自由基、增强免疫力、降糖和改善心血管疾病等作用［2－4］。

黄芪甲苷的含
量是评价黄芪及其制剂质量的重要指标，且许多中成药也以黄芪甲苷作为该品种的指示成分，在《中国药典》中黄芪甲苷被作为黄芪质量检测的标志物。

笔者在前人研究［5－6］的基础上，试用HPLC－UV法测定黄芪干燥根中的黄芪甲苷含量，同时对野生、膜荚、蒙古3种不同来源的黄芪样本进行了黄芪甲苷含量比较。

1.1.1 材料。

人工栽培样本为2年生的来自内蒙古兴和、达茂旗、赤峰(蒙古黄芪)、兴安盟(膜荚黄芪)的黄芪干燥根以及来自甘肃的黄芪干根切片(成品);野生黄芪为采自内蒙古武川县的多年生黄芪。

1.1.2 试剂。

黄芪甲苷对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号:110781－200613)，D101型大孔吸附树脂(购自沧州宝吸附材料有限公司)，色谱级甲醇、
色谱级乙腈、水饱和正丁醇、氨水溶液、去离子纯水、无水乙醇。

1.1.3 仪器及耗材。

TL-2010高通量组织研磨仪、旋转蒸发仪(RV10)、岛津高效液相色谱仪(LC-20A型，紫外检测器)、电子天平、水浴锅、超声波清洗器、索式提
取器、玻璃层析柱、圆底烧瓶、分液漏斗、0.45 μm 虑器等。

1.2.1 黄芪甲苷的制备。

研磨后精密称取4 g黄芪粉末于索式提取器中，按药典［1］的方法提取，用5 ml色谱级甲醇定容，最后用0.45 μm滤器过滤于棕色样品瓶中，4℃保存备用。

1.2.2 对照品溶液制备。

精密称取黄芪甲苷0.002 5 g，加甲醇定容至5 ml容量瓶中，摇匀。

用0.45 μm滤器过滤后，转至棕色瓶中4℃保存。

1.2.3 色谱条件与系统适用性。

色谱柱为Kromail C18柱(250 mm ×4.6 mm)，流动相为乙腈－水(32∶68)，流速为1.0 ml/min，检测波长为203 mm，柱温箱35℃。

1.2.4 测定法。

自动进样器吸取对照溶液和供试品溶液各20 μl上样，进入高效液相色谱仪，测定，记录色谱峰面积，以外标一点法计算含量。

1.2.5 方法学的建立。

从线性范围、精密度、稳定性、重复性、回收率5个方面对HPLC－UV法测定黄芪甲苷含量进行方法学考察。

1.2.6 样品含量测定。

用上述建立的方法，对不同地区及来源的黄芪样品进行甲苷含量测定，进一步比较其含量差异。

2.1 线性范围精密称取黄芪甲苷标准品，适量，加甲醇制成对照品溶液(相当于每1 ml含0.5 mg黄芪甲苷)，精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ml分别置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

取上述溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

以黄芪甲苷峰面积为纵坐标Y、溶液浓度为横坐标X，得到回归方程为y=2×106X－5 940，R2=0.999(n=5)，结果表明，在 0.05 ～0.50
mg/ml，范围内，黄芪甲苷对照品浓度与色谱峰面积值呈良好的线性关系(图1)。

2.2 精密度考察取黄芪甲苷对照品溶液(0.5 mg/ml)20 μl注入液相色谱仪，连续测定6次，其色谱峰面积分别为748 575、744 819、749 966、743 239、740 912、749 204，相对标准偏差RSD为0.48%，表明该测定方法精密度非常好。

2.3 稳定性考察取样品(产地达茂旗)，按含量测定中供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，分别在放置0、2、4、6、8、10、12 h时，按以上色谱条件及测定法测定，结果发现其光谱峰面积分别为276 752、269 907、270 554、276 911、278 426、266 715、256 167，相对标准偏差为2.87%，可见供试品溶液在12 h
内基本稳定。

2.4 重复性考察取同一批次样品(甘肃)4份，分别按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，再按以上色谱条件及测定法测定，并计算每份样品中黄芪甲苷的含量。

结果发现，4份样品的光谱峰面积平均为122 374，RSD=2.93%，表明该方法重复良好。

2.5 回收率考察精密量取同一批号已知含量(0.552 mg/ml)的供试品溶液，分别
与等量黄芪甲苷对照品溶液(0.01、0.50、1.10 mg/ml)混合，制备高、中、低 3
种浓度的供试品溶液，每浓度平行操作3份，并按上述色谱条件及测定法测定，
计算回收率。

由表1可见，回收率在91% ～101%的范围内，平均回收率为
98.216%(RSD=2.85%，n=9)，回收率和测定误差均符合含量测定要求。

2.6 样品含量检测经测定，达茂、兴河、甘肃不同产地黄芪的黄芪甲苷含量分别
为0.361、0.143、0.161 mg/g，蒙古、膜荚、野生不同来源黄芪的黄芪甲苷含量分别为0.203、0.221、0.410 mg/g，比较其差异性(图2)发现，黄芪甲苷含量不
同产地的测定结果是达茂＞甘肃＞兴河，不同来源的测定结果是野生黄芪＞膜荚黄芪≈蒙古黄芪。

2.7 层析与未层析的比较该试验对同一样品(甘肃)进行了通过D101大孔吸附树脂柱层析与不层析的比较，结果发现层析峰面积为118 606，未层析峰面积为64 528，且层析后样品甲苷含量值高于未层析，其与标品的重叠对比如图3所示。

关于黄芪甲苷的检测方法有很多，但各自有其不同的缺点，如已有的薄层扫描法和香草醛－硫酸比色法，前者操作繁琐，背景干扰多，误差较大;后者空白吸收值高，受时间因素干扰大，均难以准确测定。

近年来用高效液相色谱法检测药材中成分含量成为一种主流，如《药典》中用的液相色谱法，用蒸发光散射器(HPLC－ELSD)对黄芪甲苷含量检测做了详细论述，但蒸发光散射器在使用过程中与紫外检测器(UV)相比，蒸发光散射器和高效液相色谱连接时需要信号转换，转换器价格昂贵、
使用不便，还需要配置高压氮气或空气，且试验中产生废气有害;而紫外检测法则不仅灵敏度高、噪音低、线性范围宽、有较好的选择性，且对环境温度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，因此既可用于等浓度洗脱，也可用于梯度洗脱。

鉴于以上原因，该试验对HPLCUV法测定黄芪药材中的黄芪甲苷含量进行了方法学考察，结果发现，在流动相为乙腈∶水(32∶68)、流速 1.0 ml/min、检测波长203 nm的检测条件下，黄芪甲苷在0.05～0.50 mg/ml范围内线性关系良好，平均回收率为98.216%(RSD=2.85%)，符合检测要求。

该试验考察了内蒙古地区不同来源黄芪样本中的黄芪甲苷含量，结果发现野生黄芪样本中的黄芪甲苷含量大约是栽培样本的2倍，这可能是在人工栽培过程中，使用了大水大肥导致主成分含量有所下降;而蒙古黄芪与膜荚黄芪的黄芪甲苷含量基本一致，进一步证明了其在长期栽培过程中人工选择的结果。

该试验还对提取的黄芪样品进行了层析与未层析差异比较，由于通过D101吸附树脂的药材相当于样品纯化浓缩的过程，所以相对含量测定结果会比未层析的含量高，这与李晓燕等研究的经大孔吸附树脂纯化后的样品含量有所提高［7］结论一致。

在此应用建立的HPLC－UV法对不同地区及不同来源的黄芪干燥根进行黄芪甲苷含量测定比较，其具体数值因样本个体差异不具有大范围的代表性，故其结果仅供未来HPLC－UV法测定黄芪干燥根中甲苷含量研究的一个参考。

【相关文献】
［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:284.
［2］张丽敏，贺永贵，伊红丽，等.黄芪甲苷药理作用研究进展［J］.河北联合大学学报:医学版，2014，16(2):160 －162.
［3］ZHU Z H，WAN H T，LI J H，et al.Chuanxiongzine astragaloside IV decreases IL-1β and Caspase-3 gene expressions in rat brain damaged by cerebral ischemia/reperfusion:A study of real-time quantitative PCR assay［J］.Acta Physiol Sin，2011，63(3):272 －280.
［4］孙聪，韩业超，吴强.高效液相色谱法测定保元清血颗粒中黄芪甲苷含量方法的建立及评价［J］.吉林大学学报:医学版，2012，38(4):805－808.
［5］闵庆璐，张世轩，陈晓明.HPLC－UV法测定丹黄祛瘀片中黄芪甲苷的含量［J］.中华中医药
学刊，2011，29(7):1678 －1680.
［6］王希斌，钟小斌，黎渊弘，等.高效液相色谱法测定复方黄龙汤黄芪甲苷含量［J］.医药导报，2013，32(8):1069 －1071.
［7］李晓燕，王永，吕洁，等.大孔吸附树脂分离纯化黄芪甲苷的工艺研究［J］.河北中医药学报，2011，26(30):41－43.。