第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列分析_PPT幻灯片
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基因工程的主要技术原理课件
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶 CCC
CCC
基因工程的主要技术原理课件
基因工程%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N= ln (1- 1n)
蛋白B 转录激活domain
DNA binding domain 蛋白A
上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因
基因工程的主要技术原理课件
不能转录
（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合
GAL4的DB domain与AD Domain也能 靠近，所以能启动效应基因的转录。
蛋白A
蛋白B
DNA binding domain 转录激活domain 激活转录
基因工程的主要技术原理课件
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
基因工程的主要技术原理课件
第二章 基因工程的主要技术原理
基因工程的主要技术原理课件
五 .分子杂交技术
1、Southern blot
原理和方法:
双链DNA
限制性内切酶 消化
电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH变性
NaOH或高温变性
标记的探针
基因工程的主要技术原理课件
应用: ➢ 基因拷贝数检测; ➢基因筛选, 获取目的基因; ➢遗传疾病诊断; ➢转基因样品检测, 等…
（3）cDNA的合成
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶 CCC
CCC
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基因工程%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N= ln (1- 1n)
蛋白B 转录激活domain
DNA binding domain 蛋白A
上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因
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不能转录
（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合
GAL4的DB domain与AD Domain也能 靠近，所以能启动效应基因的转录。
蛋白A
蛋白B
DNA binding domain 转录激活domain 激活转录
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（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
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第二章 基因工程的主要技术原理
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五 .分子杂交技术
1、Southern blot
原理和方法:
双链DNA
限制性内切酶 消化
电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH变性
NaOH或高温变性
标记的探针
基因工程的主要技术原理课件
应用: ➢ 基因拷贝数检测; ➢基因筛选, 获取目的基因; ➢遗传疾病诊断; ➢转基因样品检测, 等…
（3）cDNA的合成
基因工程的原理和技术ppt
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序列, 又可以怎样操作？
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
基因工程的基本原理和技术ppt课件
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
48
⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。
粘质沙雷氏杆菌 SmaⅠ（Serratia marcesens）
大肠杆菌 EcoRⅠ （Escherichia coli R）
36
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
37
③类型：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
38
寻根问底
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
摩尔根证明基因在染色体上，并提出基
因的连锁互换定律。
11
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从
一种生物个体转移到另一种生物个体。
12
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。13
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
46
课堂练习
2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
47C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
基因工程的主要技术原理文稿演示
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。
（4）沉淀DNA 用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。
（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。
（5）除去RNA污染 用RNase A。
三、DNA的定量和纯度测定
1. 紫外光谱法 原理： DNA（或 RNA）在260nm波长处 有特异的紫外吸收峰。
变性 强碱
DNA单链 中性
复性
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性 后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构， 与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心 的时候沉淀下去。
变性
（2） 所用的试剂作用
① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH>8）下有活性。
蛋白质在280nm处有吸收峰
用微量比色杯（10l）在紫外分光光 度计直接测定。
2
2. 琼脂糖凝胶电泳估计
原理： 溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中， 紫外光照射下能发 红色荧光。
与已知浓度的DNA电泳带荧光强度 对比，就可以估计出DNA含量。
一般过程及原理： （1）组织粉碎 动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研 磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接 使用。
（2）细胞裂解
O CH3—(CH2)11—O—S—ONa
O
0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。
SDS是离子型去垢剂（detergent），可 以使细胞膜崩解。
2. 影响质粒DNA产量的因素
最重要的是： 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。
（1）受体菌株
（3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。
（4）沉淀DNA 用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。
（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。
（5）除去RNA污染 用RNase A。
三、DNA的定量和纯度测定
1. 紫外光谱法 原理： DNA（或 RNA）在260nm波长处 有特异的紫外吸收峰。
变性 强碱
DNA单链 中性
复性
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性 后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构， 与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心 的时候沉淀下去。
变性
（2） 所用的试剂作用
① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH>8）下有活性。
蛋白质在280nm处有吸收峰
用微量比色杯（10l）在紫外分光光 度计直接测定。
2
2. 琼脂糖凝胶电泳估计
原理： 溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中， 紫外光照射下能发 红色荧光。
与已知浓度的DNA电泳带荧光强度 对比，就可以估计出DNA含量。
一般过程及原理： （1）组织粉碎 动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研 磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接 使用。
（2）细胞裂解
O CH3—(CH2)11—O—S—ONa
O
0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。
SDS是离子型去垢剂（detergent），可 以使细胞膜崩解。
2. 影响质粒DNA产量的因素
最重要的是： 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。
（1）受体菌株
基因工程-PowerPoint演示文稿
（利1进）行与是人因工为合根成瘤N菌H3所、需蓝的藻高体温内、含高有压特条定件的相酶比，生物，固这氮类的物顺
质的化学本质是 蛋白质
。
（2）人们正在着力研究转基因固氮植物（如固氮水稻、固氮小 麦等），某科学家将根瘤菌、细胞中的固氮基因，通过基因工程 方法转移到水稻植株细胞中，经检测，转基因水稻具备了固氮功 能。据上述材料分析：
（5）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种
的主缩要短优育点种时间 克服远缘杂交
9、静夜四无邻，荒居旧业贫。。22.8.822.8.8Monday, August 08, 2022
10、雨中黄叶树，灯下白头人。。08:27:2008:27:2008:278/8/2022 8:27:20 AM
（2）将目的基因连接到载体上，得杂化载体；（3）将杂化载体 （环状的DNA）引入宿主细胞（受体细胞），使目的基因及载体上 其它基因得以转录和翻译。
例题解析
1、 农业上大量使用化肥存在许多负面影响，“生物固氮”已 成为一项重要研究课题，实验证明，生物固氮是某些微生物（如 根瘤菌、蓝藻等）将空气中的N2固定为NH3的过程。
17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。上午8时27分20秒上午8时27分08:27:2022.8.8
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blandit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis ut cursus.
感 谢 您 的 11、越是没有本领的就越加自命不凡。22.8.808:27:2008:27Aug-228-Aug-22
基因工程的原理和技术PPT课件
（1）将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法
（2）将重组DNA导入动物细胞
显微注射技术
提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵
受精卵移植
（3）如果是导入微生物（如细菌）
目的基因
重组质粒
氨苄青霉素抗性基因
（标记基因）
将细菌用CaCl2处理，使 细胞处于感受态，可促 进细胞吸收DNA分子
大肠杆菌的拟核
用限制酶 切成许多
片断
②利用PCR技术扩增目的基因
聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基 因。
聚合酶链式反应（PCR技术）
变性：双链DNA解链 成为单链DNA
复性（退火）：部 分引物与模板的单 链DNA的特定互补部 位相配对和结合
延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链
1.第一步：目的CR)技术扩增目的 基因（目的基因的序列已知） ③化学方法合成目的基因基 因的许多DNA片断，导入受 体菌的群体储存，各个受体 菌体
小片段DNA
重组DNA分抗虫蛋 白的菌落
该菌落所携带 形成重组DNA分子（构建基因表达载体)
通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的 粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子 （基因表达载体）。
用荧光分子或放射性 同位素标记
看能否形 成杂合的
双链区
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
检测—
方法: DNA分子杂交
过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNA B.用含目的基因的DNA片段( 单链)用放射性同位素等作标 以此做探针 C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明目的基因已插入染色体DNA中
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 DNA核酸序列分析历程
60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和 研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实
第一，如何分离寡核苷酸片段；
另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。
变性胶电泳分离反应混 合物。
放射自显影术，检测单 链 DNA 片 段 的 放 射 性 带 。 结果判读，从放射性X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
考考你
ddATP ddTTPddGTP ddCTP
ddCTP ddATP ddGTP ddTTP
将待测DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形 的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作DNA序列分析。 这种方法特称为利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA 序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列， 所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列 分析法。
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虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言， 化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度 也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中 仍被采用。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
返回 西基本技术原理-DNA序列测定
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
反应：同时加入引物和 模板、DNA聚合酶1、一 种 ddNTP、 以 及 四 种 dNTP（有一种带放射性 标记）。
所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样， 就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。
应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种 最普遍采用的快速的DNA序列分析法。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1.3 Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
M13载体克隆DNA片段
将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中 重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白 色的噬菌斑; 非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。
从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链 DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。
克服缺点的一种途径—DNA分子克隆
将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载 体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为 载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。
引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA 中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分 子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物” 。
G
A
T
G
A
T
C
C
G T T G
A G G
A
A
C
T
G
C
C
A
C
C
C
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基因工程 酶、原料比例
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
dNTP／ddNTP=100：1时，谱带分离效果较佳，可读出多 于 200个以上的核苷酸顺序。
降低dNTP对ddNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配 合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到 能判读出300个左右的核苷酸顺序。
然后按双脱氧法作序列分析。
优 点 ： 无 需 将 DNA 克 隆 到 M13 载 体上，更为简单快速，现已被许 多研究工作者采用。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法
是1977年由美国哈佛大学的A．M．Maxam和W． Gilbert 发明的，所以又叫做Maxam－Gilbert DNA 序列分析法
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
总起顺这 来序种 ，的随
序恢测机 列复定的 。成将方
原派法 来生， 结的也 构序需 形列要 式拼通 的连过 西北师范大学 精品课程 武国凡
DNA
基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
使用M13载体系列的优点
基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法基本步骤
➢待测DNA与pBR322或pUC分子
重组；
➢转 化 ： 转 化 反 应 物 涂 布 在 补 加
有Xgal-IPTG选择性培养基平板上， 经37℃过夜培养；
➢挑选白色菌落，制备质粒NA。
➢碱变性处理，与引物一起退火，
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法
引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷
高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制 片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳 分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。
基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 ■ 2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法■ 2.5.3 序列分析自动化■ 2.5.4 杂交测序■ 2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题■ 2.5.6 思考问题■
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为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排” 起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对 同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。
DNA
策分 得析 高： 分这 子样 量处
理 后 吗， ？能
费时、费力、费钱、DNA损伤严重
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定