第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列分析_PPT幻灯片

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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法基本步骤
➢待测DNA与pBR322或pUC分子
重组；
➢转 化 ： 转 化 反 应 物 涂 布 在 补 加
有Xgal-IPTG选择性培养基平板上， 经37℃过夜培养；
➢挑选白色菌落，制备质粒NA。
➢碱变性处理，与引物一起退火，
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2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法
引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷
高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制 片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳 分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。
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2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 DNA核酸序列分析历程
60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和 研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实
第一，如何分离寡核苷酸片段；
另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。
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DNA
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使用M13载体系列的优点
然后按双脱氧法作序列分析。
优 点 ： 无 需 将 DNA 克 隆 到 M13 载 体上，更为简单快速，现已被许 多研究工作者采用。
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2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法
是1977年由美国哈佛大学的A．M．Maxam和W． Gilbert 发明的，所以又叫做Maxam－Gilbert DNA 序列分析法
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来自百度文库
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M13载体克隆DNA片段
将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中 重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白 色的噬菌斑; 非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。
从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链 DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。
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2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 ■ 2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法■ 2.5.3 序列分析自动化■ 2.5.4 杂交测序■ 2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题■ 2.5.6 思考问题■
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克服缺点的一种途径—DNA分子克隆
将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载 体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为 载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。
引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA 中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分 子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物” 。
虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言， 化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度 也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中 仍被采用。
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反应：同时加入引物和 模板、DNA聚合酶1、一 种 ddNTP、 以 及 四 种 dNTP（有一种带放射性 标记）。
变性胶电泳分离反应混 合物。
放射自显影术，检测单 链 DNA 片 段 的 放 射 性 带 。 结果判读，从放射性X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。
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考考你
ddATP ddTTPddGTP ddCTP
ddCTP ddATP ddGTP ddTTP
为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排” 起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对 同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。
DNA
策分 得析 高： 分这 子样 量处
理 后 吗， ？能
费时、费力、费钱、DNA损伤严重
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将待测DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形 的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作DNA序列分析。 这种方法特称为利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA 序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列， 所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列 分析法。
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所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样， 就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。
应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种 最普遍采用的快速的DNA序列分析法。
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2.5.1.3 Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法
G
A
T
G
A
T
C
C
G T T G
A G G
A
A
C
T
G
C
C
A
C
C
C
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基因工程 酶、原料比例
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dNTP／ddNTP=100：1时，谱带分离效果较佳，可读出多 于 200个以上的核苷酸顺序。
降低dNTP对ddNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配 合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到 能判读出300个左右的核苷酸顺序。