木霉纤维素酶基因的克隆与表达研究进展[1]

第12卷第4期2004年12月纤维素科学与技术
Journal of Cellulose Science and Technology
Vol.12 No.4
Dec. 2004
文章编号：1004-8405(2004)04-0038-06 ●综述评论●木霉纤维素酶基因的克隆与表达研究进展
张磊，吴兴泉*
（郑州工程学院生物工程系，河南郑州450052）
摘要：对自然界中能够产生纤维素酶完全酶系的丝状真菌木霉的纤维素酶
基因克隆与表达的研究进展进行了综述，主要包括基因克隆，转化载体，以
及基因表达等分子生物学方面的研究。

关键词：木霉；纤维素酶基因；克隆；表达
中图分类号：Q93 文献标识码：A
木霉（Trichoderma spp.）是一类在各种气候带的土壤中能够普遍存在的一种多细胞丝状真菌[1]。

最近的研究表明，他们与其他寄生真菌一样，是机会主义的，无毒的植物共生生物[2]。

其中主要包括：瑞氏木霉（Trichoderma reesei），绿色木霉（Trichoderma viride），康宁木霉（Trichoderma koningii）和拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoninii）等。

木霉属真菌能够分泌完全的纤维素酶系，故而在学术研究及工业生产中，都引起广泛的关注。

目前，纤维素酶的酶解效率不高，因此影响了其工业化生产和广泛应用。

20世纪80年代以来，随着分子生物技术的发展，人们通过分子克隆等新方法掌握了纤维素酶的遗传特性及催化机理。

进而为研究纤维素酶的生物合成，构建高效纤维素分解菌开辟了新的途径。

本文从木霉属真菌的基因克隆，基因表达调控等方面研究了纤维素酶分子生物学研究进展情况。

1 纤维素酶系组成及其催化机制
纤维素酶是能够降解纤维素的一组酶的总称。

通常，一个纤维素酶系中有十几到几十个组分，这些组分可分为三类：葡聚糖内切酶（endo-1,4-β-D-glucanase, EC3.2.1.4, EG），葡萄糖外切酶，也称纤维二糖水解酶（exo-1,4-β-D-glucanase, EC3.2.1.91, or cellubiohydralases, CBH），以及β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases, BG）[3~5]。

目前普遍认为，在纤维素酶水解纤维素的过程中，是三个组分协同作用的结果，EG可随机水解纤维素非结晶区的β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末
收稿日期：2004-07-27 ＊通讯联系人
基金项目：河南省高校青年骨干教师资助课题
作者简介：张磊（1978~）, 男，河南人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。

第4期张磊等：木霉纤维素酶基因的克隆与表达研究进展39
端的小分子纤维素，CBH可从纤维素线状分子的非还原性末端水解切下纤维二糖单位，BG 则将纤维二糖水解成葡萄糖。

但是，由于纤维素底物的高度复杂性以及底物的多样性，纤维素水解过程的具体细节并没有完全研究清楚[6]。

纤维素酶一般需有诱导物（纤维素）存在才能合成，受纤维素降解物葡萄糖的阻遏。

2 纤维素酶基因克隆
2.1 概况
由于利用纤维素酶的降解作用进行纤维素的生物转化有着广阔的前景，自70年代末就开始了纤维素酶基因的克隆[7]。

现已从20多种细菌和数种真菌中克隆到了80余个纤维素酶基因并被测序。

并且几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在大肠杆菌中表达[6,8]。

目前对于纤维素酶基因克隆的研究主要集中在真菌产生的酸性纤维素酶方面[7]。

真菌中编码纤维素酶的基因位于染色体上，通常随机地分布于整个基因组中，每个基因有其自己的转录调节单位[9]。

由于丝状真菌木霉属能产生大量的胞外纤维素酶，酶系较完全，并且对结晶纤维素有较好的酶解活性，近十几年来对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量的研究，并且都在Ｅ.coli中得到了表达，并测定了这些基因的核苷酸序列。

其中瑞氏木霉是研究最多的木霉，已有八个纤维素酶基因得到克隆并测序，包括编码纤维二糖水解酶的cbh1、cbh2和编码内切葡聚糖酶的egl1，egl2，egl3，egl4和egl5[1]，以及编码β-葡萄糖苷酶的bgl4和它的类似物bgl2（两者有73.1%的同源性）。

肖志壮等[10]（2001年）利用PCR方法从瑞氏木霉cDNA文库中扩增出内切葡聚糖酶Ⅰ（EndoglucanaseⅠ，EGⅠ）全长基因并克隆到酿酒酵母非整合型表达载体pAJ401上，转化到酿酒酵母中表达出具有活性的EGⅠ酶蛋白。

Takashima S等[11]（1999年）从里氏木霉中克隆得到的一种新的真菌β-葡萄糖酶基因bgl4和他的类似物bgl2。

两者有73.1%的同源性。

这两个基因均可以在曲霉中得到表达，并且重组β-葡萄糖苷酶得到纯化。

bgl4与重组里氏木霉bgl2基因相比有一定的耐热性。

并且bgl4表现出比里氏木霉bgl2基因更高的β-葡萄糖苷酶活力。

木霉属纤维素酶在加入bgl4后表现出更强的纤维素糖化作用。

有关康宁木霉纤维素酶基因研究较少（Thomas[12]，1988年），Wey 等[13]（1994年）利用康宁木霉G-39高产菌株克隆了纤维素酶CBHⅠ基因，并对其序列进行了分析，发现它与里氏木霉CBHⅠ基因仅在非编码区有六个碱基的差异，因而可以编码相同的CBHⅠ。

国内祝令香等[3]2001年克隆并测定了康宁木霉K801纤维素酶CBHⅡ基因序列，发现与T.reesei已知序列的同源性达到99.89%。

关于绿色木霉纤维素酶的研究同样较少，Cheng等[14]（1990年），Kwon等[15]（1999年）对绿色木霉HK-75中编码内切葡聚糖酶EGⅠ的基因egl 1进行了克隆和异源表达。

发现egl 1的编码区长度为1392 bp，编码一个含464个氨基酸的多肽，这个多肽与里氏木霉EGⅠ有93.8%的同源性。

国内王建荣等[16~19]（1994年）克隆并测序了绿色木霉CBHⅠ基因和CBHⅡ基因，他采用瑞氏木霉的基因序列同源性片段作探针，从构建的绿色木霉基因文库中，成功地克隆了绿色木霉CBHⅠ和CBHⅡ基因。

这些研究结果表明，木霉属中不同种间同一纤维素酶基因的序列具有相当高的同源性。

40纤维素科学与技术第12卷
研究还表明，木霉的各种纤维素酶中含有两个同样的相邻序列区域，这些同源序列位于EGⅢ的N末端，但是在EGⅠ和CBHⅠ的C末端[20]。

2.2 克隆方法
早期利用纤维素酶需诱导物存在才能合成这一特性采用差异杂交法，分别用纤维素诱导条件下和非诱导条件下所提取的mRNA制备cDNA探针，与木霉基因文库进行杂交，选择那些与前者产生强烈杂交而与后者不杂交的菌落，从中筛选到纤维素酶基因。

其他克隆基因的方法有：遗传互补法，利用具有相应营养缺陷型遗传背景的酵母菌作宿主筛选所需的酶基因；利用抗体的免疫筛选法；异源杂交法，利用其他真核生物相关的基因片段为探针对木霉cDNA文库进行原位杂交筛选，如上述王建荣等用此法克隆了绿色木霉CBHⅠ和CBHⅡ基因；反求遗传学法，由纯化的酶蛋白得出部分氨基酸序列，由此设计并合成寡聚核苷酸混合物作为探针从cDNA文库中筛选所需的酶基因[1]。

3 纤维素酶基因的载体和转化系统
由于木霉属属于半知菌，缺乏有性阶段，对其杂交育种有一定困难。

原生质体育种是一种非常有效的方法[21]。

木霉的转化系统与其他真菌转化系统相似，多为使用细菌来源的质粒构建的载体，在聚乙二醇（PEG），山梨醇和氯化钙作用下把目的基因或DNA片段引入受体原生质体，经过再生和选择获得转化子[22]。

选用一个稳定的选择标记对建立木霉转化系统是非常必要的，木霉转化的选择标记包括营养缺陷型标记和显性标记两类。

前者常用的如PyrG（或Pyr-4），后者常用的有HmR，benA 和amds，如用来自原核生物的抗性标记必须在原核基因前连接一个真菌启动子如构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的gpd启动子。

汪天虹等[23]（2003年）采用PCR技术体外扩增获得了瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHⅠ）启动子和终止子序列，并以大肠杆菌质粒pUCl9为骨架，在该启动子和终止子序列间加入多克隆位点，构建了瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL。

导致载体DNA向受体染色体DNA整合的机制有同源重组和非同源重组，同源重组产生两种转化子：一种是目的基因在染色体基因组中形成连锁的重复，一种是基因取代。

非同源重组的转化子带有目的基因的非连锁的重复。

高压电泳冲（high-voltage electric pulse）是在某些不适用PEG的情况下木霉转化的替代方法。

克隆基因在转化子中的表达水平与多种因素如载体所用启动子及其它序列，克隆基因本身，目的基因整合位置，整入的拷贝数及受体菌株有关。

4 纤维素酶基因的表达调控
对木霉产生的多种纤维素水解酶类的表达调控已进行了广泛的研究。

瑞氏木霉研究过的
第4期张磊等：木霉纤维素酶基因的克隆与表达研究进展41
纤维素酶基因有8个：编码纤维二糖水解酶的cbh1，cbh2，编码内切葡聚糖酶的egl1，egl2，egl3，egl4，egl5以及编码葡萄糖苷酶的bgl2。

这些基因已在E.coli中得到表达。

王建荣等[14]（1994年）以噬菌体lambds EMBL3DNA为载体，克隆了绿色木霉高分子量基因组DNA 的部分酶解片段，并将重组分子进行体外包装后侵染E.coli K802，由此构建了绿色木霉基因文库。

陈新爱等[24]（2002年）采用RT-PCR技术，经限制性内切酶酶切，DNA序列分析，获得了里氏木霉纤维二糖酶基因bgl2编码区的全长cDNA克隆，并将其克隆到温度敏感型原核表达载体pJW2中表达。

几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在大肠杆菌中得到表达。

但是这一体系表达率低，产生的酶多数不能分泌到胞外。

为了得到胞外分泌产物，一些纤维素酶基因已在枯草芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，乳酸发酵短杆菌和变青链霉素等中得到了有效表达。

但由于纤维素酶基因在异源宿主中的表达要遇到蛋白酶水解和糖基化等问题，分泌机制尚不清楚，无法达到纤维素酶生产要求。

纤维素酶基因在酵母中的表达是纤维素酶用于工业生产的一个重要途径。

但是，目前利用酵母表达外源纤维素酶基因的水平有限，故如何建立有效的纤维素酶基因真菌表达体系，提高酵母表达纤维素酶的产量将是一个重要的研究课题[4]。

由于酵母不产生毒素，用其表达纤维素酶基因，其产物高度糖基化，表达水平高，而且产物直接分泌至胞外，所以酵母表达系统的应用研究较多。

早在1987年，Penttila M E等[25]已经能够将丝状真菌里氏木霉中得到的两种内切葡聚糖酶的cDNA的拷贝在酵母磷酸甘油酸激酶基因启动子的调控下在真核表达系统酿酒酵母中表达。

Godbole等[26]将T.reesei CBHⅠ在Pichiapastoris中成功地转化并表达，发现P. pastoris对里氏木霉CBHⅠ的定向诱变并不理想。

肖壮志等[10]采用刚果红染色法从T.reesei cDNA文库中筛选到egl3基因，转化到酿酒酵母中成功表达，进而还比较了酿酒酵母的蛋白质分泌系统组分SSO 2和SEB 1对EGⅢ分泌的影响，研究结果显示T.reesei EGⅢ在酿酒酵母细胞中的表达时，其mRNA 5’端先导序列中可能存在影响该基因表达水平的调控序列。

近年来，以Aspergillusoryzaee为表达系统的研究也渐渐趋于增多。

Takashima等将T.reesei的bgl2基因在A.oryzae中表达成功，酶活检测显示了EG活性。

5 结语
木霉纤维素酶基因的克隆开始于20世纪70年代末，随着分子生物学技术的发展，有越来越多的纤维素酶基因得到克隆和表达。

细菌，放线菌，真菌和高等植物中都发现有纤维素酶的存在。

由于高产真菌的外分泌性在酶工业生产中具有实用价值，对其纤维素酶基因的克隆与表达成为目前应用最广泛、也将是最有前途的一项使纤维素酶活力适应工业化生产的技术。

真核表达系统是近年来新兴的用于外源基因表达的体系，它可以克服在原核表达系统中无法进行特定翻译后修饰的缺陷，已成为生产具有生物活性的真核生物蛋白的重要途径。

虽然真核基因可以方便地克隆到原核系统中，但由于真核生物与原核生物之间存在差异，因此
42纤维素科学与技术第12卷
在原核生物中只能是“体外”（in vitro）研究。

真核细胞具有很多原核细胞所没有的功能，如线粒体合成ATP的功能，形成组蛋白和核小体的功能，可以进行减数分裂，能够分化等等。

因此要想透彻地了解真核基因的功能就必须将其置于真核细胞的“体内”（in vivo）环境下。

分子生物学技术在提高纤维素酶活力中的应用，使得纤维素酶的应用更加广泛，表明通过向分子水平的发展，将会加快纤维素酶广泛应用于工农业生产的进程。

目前存在的纤维素酶表达载体无法避免纤维素酶酶解产物葡萄糖的反馈抑制，通过分子生物技术在该项研究中的进一步应用，我们可以通过构建不受葡萄糖抑制的真核表达系统，从而使纤维素酶基因得到高效表达，较大幅度地提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶能力，使它能够有效地应用于广泛的工农业生产。

参考文献：
[1] 汪天虹, 吴静, 邹玉霞. 瑞氏木霉分子生物学研究进展[J]. 菌物系统, 2000, 19(1): 147-152.
[2] Harman G E, Howell C R, Viterbo A, et al. Jan Trichoderma species—opportunistic, avirulent
plant symbionts[J]. Nat Rev Microbiol, 2004, 2(1): 43-56.
[3] 祝令香, 于巍. 康宁木霉K801纤维素酶CBHⅡ基因的克隆及序列分析[J]. 菌物系统, 2001,
20(2): 174-177.
[4] 董秀芹. 秸杆固态发酵酒精高产菌株的选育[D]. 中国农业大学硕士论文. 北京: 中国农业大
学, 2001, 6. 1-53.
[5] Messner R, Kubicek-Pranz E M. CellobiohydrolaseⅡ is the main conidial-bound cellulase in
Trichoderma reesei and other Trichoderma strains[J]. Arch Microbiol, 1991, 155(6): 601-606. [6] 王晓芳. 产纤维素酶的真菌筛选与纤维素酶的诱导及其理化性质研究[D]. 南京师范大学硕
士学位论文. 江苏南京: 南京师范大学, 2002, 4. 10-11.
[7] 胡利勇, 钟卫鸿. 纤维素酶基因克隆及其功能性氨基酸研究进展[J]. 生物技术, 2003(4):
43-44
[8] 刘纯强, 王祖农. 纤维素酶基因克隆及应用前景[J]. 生物工程进展, 1991, 11(3): 8-15.
[9] 张鸿雁, 陈锡时. 微生物纤维素酶分子生物学研究进展[J]. 生物技术, 2003(6): 41-42.
[10] Xiao Z, Wang T. Cloning and expression of Trichoderma reesei endoglucanase Ⅲ (EGⅢ) gene in
Saccharomyces cerevasiae[J]. Wei Sheng Wu Xue Bao, 2001, 41(4): 391-396.
[11] Takashima S, Nakamura A. Molecular cloning and expression of the novel fungal beta-glucosidase
genes from Humicola grisea and Trichoderma reesei[J]. Biochem (Tokyo). 1999, 125(4): 728-736.
[12] Thomas M. Wood cellulase of Trichoderma koningii[J]. Methods in Enzymology, 1998, 160:
221-240.
[13] Wey T T, Hseu T H, Huang L. Molecular cloning and sequence analysis of the cellobiohydrolaseⅠ
gene from Trichoderma koningii G-39[J]. Curr Microbiol, 1994, 28(1): 31-39
[14] Cheng C, Norihiro T, Shigezo U. Nucleotide sequence of the cellobiohydrase gene from
Trichoderma viride[J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18: 55-59.
第4期张磊等：木霉纤维素酶基因的克隆与表达研究进展43
[15] Kwon I, Ekino K, Goto M, et al. Heterologous expression and characterization of endoglucanase
Ⅰ(EGⅠ) from Trichoderma viride HK-75[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1999, 63(10): 1714-1720.
[16] 王建荣, 张曼夫, 黄涛. 绿色木霉纤维素酶CBHⅡ基因的结构研究[J]. 遗传学报, 1995, 22(1):
74-80.
[17] 王建荣, 张曼夫. 绿色木霉纤维素酶CBHⅡ基因的分子克隆[J]. 真菌学报, 1994, 13(3):
235-240.
[18] 吴彤, 张曼夫. 绿色木霉纤维素酶CBHⅠ基因的cDNA分子克隆[J]. 农业生物技术学报,
1994(6): 28-36.
[19] 王建荣, 张曼夫. 绿色木霉(Trichoderma viride)基因组文库构建及其CBHⅠ基因阳性克隆筛
选[J]. 上海农业学报, 1993, 9(3): 1-5.
[20] Saloheimo M, Lehtovaara P. EGⅢ, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the
characterization of both gene and enzyme[J]. Gene, 1988, 63(1): 11-22.
[21] 峥嵘, 张功. 绿色木霉原生质体的制备与再生研究[J]. 内蒙古师范大学学报, 2002(6):
145-149.
[22] 徐同. 木霉分子生物学研究进展[J]. 真菌学报, 1996, 15(2): 143-148.
[23] 汪天虹，吴志红. 丝状真菌瑞氏木霉外源基因表达系统的构建[J]. 中国生物化学与分子生物
学报, 2003(12): 736-742.
[24] 陈新爱, 夏黎明. 里氏木霉纤维二糖酶bgl2基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达[J].
菌物系统, 2002, 21(2): 223-227.
[25] Penttila M E, Andre L. Expression of two Trichoderma reesei endoglucanases in the yeast
Saccharomyces cerevisiae[J]. Yeast, 1987, 3(3): 175-185.
[26] Godbole S, Decker S R, Nieves R A. Cloning and expression of Trichoderma reesei
cellobiohydrolaseⅠin Pichia pastoris[J]. Biotechnology Progress, 1999, 15(5): 828-833.
The Clone and Expression of Cellulase Gene
of Trichoderma spp.
ZHANG Lei, WU Xing-quan
（Department of Biological Engineering, Zhengzhou Institute of Technology, Zhengzhou 450052, China）
Abstract:Trichoderma spp. is a group of filamentous fungi that can generate cellulose. Recent research on the molecular cloning and expression of cellulose gene of Trichoderma spp. is reviewed in this article. It mainly includes: gene cloning, transformation vector systems and gene expression.
Key words：Trichoderma spp.; cellulase gene; cloning; expression。