黄芩叶斑病病原菌鉴定和药剂室内毒力测定
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ＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＴＴ
２１６增反应程序：９５℃ 预变性 ５ ｍｉｎ，９５℃ 变性
黄芩叶片，先用 ７５％ 酒精表面擦拭消毒，再用无菌水
ＩＴＳ、Ａｌｔ ａ１、ＡＴＰａｓｅ、Ｈｉｓ ３ 分别为 ５４、５７、５９、６６℃ ，反应
３０ ｓ， 共 ３０ 个 循 环； ＰＣＲ 反 应 体 系 ２５ μＬ： ２ × ＰＣＲ
菊 ［１０］ 和二月兰 ［１１］ 等多种作物叶斑病。 甘肃省农业科
学院植物保护研究所经济作物病害研究室于 ２０２０ 年
８ 月在甘肃省陇西县对黄芩病害调查时发现，叶斑病
的病田率达 ５０％，病株率达 ２０％ ～ ３５％。 田间大面积
黄芩叶片上普遍出现不规则的黑褐色病斑，扩展至整
收稿日期：２０２１⁃１１⁃０５ 接受日期：２０２２⁃０１⁃１５
株用打孔器切取直径为 ５ ｍｍ 的菌饼，菌丝面朝下、贴
３０ ｓ，７２℃ 延伸 ４５ ｓ，７２℃ 补充延伸 ５ ｍｉｎ， 退火温度
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２ ５ μＬ，ＤＮＡ １ μＬ，正反向引物各 １ μＬ，
ｄｄＨ ２ Ｏ ９ ５ μＬ。
制备 １ ２％ 琼 脂 糖 凝 胶，１２０ Ｖ 电 泳 ３０ ｍｉｎ，０ ５
基金项目：甘肃省农业科学院科研条件建设及成果转化项目（ ２０２０ＧＡＡＳ２５，２０２０ＧＡＡＳ３８） ，国家重点研发计划（ ２０１８ＹＦＤ０２０１１００） ，甘肃省科技
计划项目（２０ＹＦ３ＮＡ０２１）
作者简介：蒋晶晶，女，助理研究员，主要从事经济作物病害研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｊｉｎｇｚｉｙｕ＠ １６３．ｃｏｍ
ｍｇ·Ｌ
－１
ＥＢ 溶液中染色 １０ ｍｉｎ，置于 Ｇｅｌ． Ｄｏｃ ２０００ 型
凝胶成像仪（ 美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司） 进行拍照保存。 将具
特异性条带 ＰＣＲ 产物送上海生工生物工程有限公司
测序，所测序列与 ＮＣＢＩ 的 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中已知核
酸序列进行相似性比较。 采用 ＤＮＡＭＡＮ ７ 软件对核
物。 从药用植物学角度，黄芩分为根、茎叶、种子和种
（ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋｕｈｎ．） 引起的茎基腐病和灰葡萄孢
（ Ｌａｂｉａｔａｅ） 黄芩属（ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ） 植物，是多年生草本植
壳四个部位，主要有效成分为黄酮类化合物，具有清热
燥湿、泻火解毒、抗炎、抗肿瘤等药理作用。 黄芩广泛
摘 要：为探究黄芩叶斑病的病原种类，筛选有效的杀菌剂，本研究从甘肃省定西市陇西县黄芩主产区采
集黄芩叶斑病病叶，采用组织分离法进行病原物的分离，通过病原菌的形态特征并结合 ｒＤＮＡ 转录间隔
区（ ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ） 、过敏原基因（ Ａｌｔ ａ１） 、质膜腺苷三磷酸基因（ ＡＴＰａｓｅ） 和组蛋白基因（ Ｈｉｓ ３）４ 个基因序列
１ ３ １ 纯培养特征 用灭菌打孔器在菌落边缘打出
菌株重复 ３ 次，２５℃ 黑暗条件下培养 ７ ｄ 后观察记录
１ １ 试验材料
菌落形态和颜色等特征。
１ １ １ 样品采集 于 ２０２０ 年 ８ 月在甘肃省陇西县黄
１ ３ ２ 分生孢子形态观察和鉴定 将菌饼分别接种
集，每个地区随机选取 ３ ～ ５ 块田进行病叶调查和采
格孢（ Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ） 均有较好的抑菌作用，ＥＣ ５０ 分别为 ０ ０６ 和 ０ ０４ ｍｇ·Ｌ －１ 。 本研究在国内首次报道了
茄链格孢（ Ａ． ｓｏｌａｎｉ） 和细极链格孢（ Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ） 是引起黄芩叶斑病的病原菌，可为科学诊断该病害、研
究其发生规律和田间防治提供理论基础和科学依据。
Ａｌｔ－Ｆ
ＡＴＧＣＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣ
ＩＴＳ４
Ａｌｔ－Ｒ
质膜腺苷三磷酸 ＡＴＰａｓｅ 序列
Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＡＴＰａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
组蛋白序列
Ｈｉｓｔｏｎｅ ３（ Ｈｉｓ ３）
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
ＡＴＰＤＦ１
ＡＴＰＤＲ１
ＨＩＳ３－Ｆ
ＨＩＳ３－Ｒ
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ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡ ＡＴＧＣ
ＡＣＧＡＧＧＧＴＧＡＹＧＴＡＧＧＣＧＴＣ
ＡＴＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＴＣＧ
ＴＣＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＡＴＡＧＣＣ
ＡＣＴＡＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＧＧ
毒 ４０ ｓ，无菌水冲洗 ２ 次后置于灭菌滤纸上晾干。 将
病组织块接种于 ＰＤＡ 培养基上，每皿 ４ 块，置 ２５℃ 恒
温培养箱中黑暗培养 ４ ｄ，待长出菌落后挑取菌落边缘
菌丝进行纯化，并转接至 ＰＤＡ 斜面，４℃ 保存备用。
田间防治提供理论依据。
１ ３ 病原菌形态鉴定
１ 材料与方法
直径 ５ ｍｍ 的菌饼，接种在 ＰＤＡ 培养基的中央，每个
黄芩具有产量高、品质佳、功效好等优势。 近年来，由
生在 植 物 上， 可 引 起 莴 笋 ［７］ 、 樱 桃 ［８］ 、 枸 杞 ［９］ 、 甜 叶
亚
［１］
。 在我国，黄芩主产于甘肃、陕西、山西等省
（ Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｓｐ．） 引 起 的 白 粉 病 ［４］ 、 立 枯 丝 核 菌
［２］
其中甘肃省定西市作为道地黄芩主产区之一，生产的
９７％ 咯菌 腈 （ Ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ） 原 药 （ 河 北 冠 龙 农 化 有 限
公司） 。
（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ， ＣＴＡＢ） 法［１６］ 提 取 菌
列（ＩＴＳ） ［１７］ 、过敏原基因（ Ａｌｔ ａ１） ［１８］ 、质膜腺苷三磷酸
基因（ＡＴＰａｓｅ） ［１９］ 、组蛋白基因（Ｈｉｓ ３）进行 ＰＣＲ 扩增，引
徐美蓉５，∗ 漆永红１，∗
（ １ 甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州 ７３００７０；２ 甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州 ７３００７０；
３
定西市植保植检站，甘肃 定西 ７４３０００；４ 甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃 兰州 ７３００７０；
５
甘肃省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，甘肃 兰州 ７３００７０）
于市场需求量的增加，黄芩种植面积逐步扩大，生产上
连年种植，导致黄芩病害出现明显加重的趋势。 目前，
国内外已报道的黄芩病害和其病原种类为：由镰孢属
（ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．） 引 起 的 根 腐 病
［３］
、北方根结线虫
（ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ） 引起的根结线虫病、 齐整小核菌
世界已描述的链格孢种有约 ５００ 个，其中 ９５％ 以上寄
分布于 温 带 和 热 带 山 脉 地 区， 遍 及 欧 洲、 北 美 和 东
（ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐｅｒｓ．） 引起的灰霉病 ［５］ 等， 但引起黄
芩叶斑病的病原菌相关研究仍鲜见报道。
链格孢属（ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐ．） 是一种极为常见的病原
，
菌，具有适应强、寄主范围广、为害严重等特点 ［６］ 。 全
∗
通讯作者：徐美蓉，女，实验师，主要从事农产品质量安全与农药残留分析研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｘｕｍｅｉｒｏｎｇ＠ ｇｓａｇｒ．ａｃ．ｃｎ；
漆永红，男，副研究员，主要从事经济作物病害研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｑｉｙｏｎｇｈｏｎｇ９２０＠ ｇｓａｇｒ．ａｃ．ｃｎ。 同为通讯作者。
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关键词：黄芩； 叶斑病； 细极链格孢； 茄链格孢； 毒力测定
ＤＯＩ：１０ １１８６９ ／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００⁃８５５１ ２０２２ １１ ２１６６
黄 芩 （ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ ） 为 唇 形 科
（ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ Ｓａｃｃ．） 引 起 的 叶 枯 病、 白 粉 菌 属
１１ 期
２１６７
黄芩叶斑病病原菌鉴定和药剂室内毒力测定
个叶面，导致叶片发黄，枯萎；植株光合作用严重受阻，
１ ２ 病原菌分离和纯化
造成巨大的经济损失，严重影响黄芩的产量和品质。
采用常规组织分离法 ［１２－１３］ 进行病原菌分离。 选
择具有典型叶斑病症状的叶片，剪病健交界处 ５ ｍｍ ×
因此，本试验采用组织分离法对黄芩叶斑病的病原菌
纸浸湿，后置于 ２５℃ 生化培养箱，保湿并在 １２ ｈ 光照 ／
１２ ｈ 黑暗交替下培养 ５ ～ ９ ｄ 后在光学显微镜下拍照。
１ ４ 病原菌基因组 ＤＮＡ 提取及多基因分子生物学鉴定
将菌株接种在铺有灭菌玻璃纸的 ＰＤＡ 平板上进行
供试药剂：０ ３％ 丁子 香 酚 可 溶 液 剂 （ 保 定 市 亚
培养，５ ｄ 后 收 集 菌 丝，采 用 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵
剂（ 杨凌馥 稷 生 物 科 技 有 限 公 司 ） 、 ９８ ５％ 腐 霉 利
株基因组 ＤＮＡ。 将提取的 ＤＮＡ 用核糖体转录间隔区序
达益农农业科技有限公司） 、０ ４％ 蛇床 子 素 可 溶 液
（ Ｐｒｏｃｙｍｉｄｏｎｅ） 原 药 （ 江 西 禾 益 化 工 有 限 公 司 ） 、
核 农 学 报 ２０２２，３６（１１） ：２１６６ ～ ２１７４
２１６６
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０２２）１１⁃２１６６⁃０９
黄芩叶斑病病原菌鉴定和药剂室内毒力测定
蒋晶晶１ 赵娇娇２ 陈爱昌３ 曹素芳４ 李继平１ 李青青１
进行分离，柯赫氏法则进行致病性测定，结合形态学和
分子生物学手段对病原菌进行鉴定，旨在明确该病害
的病原菌种类，为科学诊断和研究病害发生规律提供
科学依据；同时，室内测定了 ４ 种杀菌剂对病原菌的毒
力，以期筛选出高效、低毒、低残留的药剂，为该病害的
５ ｍｍ 的病组织，用 １％次氯酸钠消毒 ４０ ｓ，７５％酒精消
养 １０ ｄ 后观察产孢情况。 将产生的分生孢子用无菌水冲
芩主产区福星镇、首阳镇、菜子镇和文峰镇进行样品采
集，共获得 ３８ 份病叶，及时带回甘肃省农业科学院植
物保护研究所经济作物病害研究室进行病原菌分离。
１ １ ２ 供 试 培 养 基 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 （ ｐｏｔａｔｏ
ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基：马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ；
对病原菌进行种类鉴定，采用菌丝生长速率法测定 ４ 种杀菌剂对病原菌的抑菌作用。 结果表明，引起陇
西县黄芩叶斑病的病原菌为茄链格孢（ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ） 和细极链格孢（ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ） ，其中细极
链格孢为优势病原菌；室内毒力测定表明，９７％咯菌腈的抑菌作用最强，对茄链格孢（ Ａ． ｓｏｌａｎｉ） 和细极链
加入琼脂 １４ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ，１２１℃灭菌备用。
１ １ ３ 供试材料 供试菌株：茄链格孢（ Ａ． ｓｏｌａｎｉ） 和
细极链格孢（ Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ） 。
至 ＰＤＡ、ＰＣＡ、ＣＭＡ 和 ＳＡ 培养基中央，１８℃ 恒温黑暗培
洗，在光学显微镜下对链格孢的分生孢子大小、颜色、产
马铃薯胡萝卜琼脂（ｐｏｔａｔｏ ｃａｒｒｏｔ ａｇａｒ，ＰＣＡ） 培养基：马
铃薯 ２０ ｇ、胡萝卜 ２０ ｇ；玉米粉（ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ａｇａｒ，ＣＭＡ）培
养基：玉米粉 ３００ ｇ、琼脂 １４ ｇ；蔗糖碳酸钙（ｓｕｃｒｏｓｅ ＣａＣＯ３
ａｇａｒ，ＳＡ）培养基：蔗糖 ２０ ｇ、碳酸钙 ３０ ｇ。 以上培养基均
物（表 １）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表 １ 引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＩＴＳ 序列
ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
过敏原 Ａｌｔ ａ１ 序列
Ａｌｌｅｒｇｅｎ Ａｌｔ ａ１ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
目标基因
Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
ＩＴＳ１
ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ
生的横隔、纵隔数进行统计，参考张天宇［１４］ 和 Ｓｉｍｍｏｎｓ
等［１５］ 对链格孢属种的描述来鉴定病原菌的种类。
１ ３ ３ 产孢表型观察 将滤纸剪成比载玻片小的长方
形，并在滤纸中间剪约 １ ｃｍ × ２ ｃｍ 的孔，将其置于载玻
片上，放入培养皿内湿热灭菌后备用。 从菌落边缘取适
量菌丝和孢子均匀涂抹在小孔一侧，加适量无菌水将滤
２１６增反应程序：９５℃ 预变性 ５ ｍｉｎ，９５℃ 变性
黄芩叶片，先用 ７５％ 酒精表面擦拭消毒，再用无菌水
ＩＴＳ、Ａｌｔ ａ１、ＡＴＰａｓｅ、Ｈｉｓ ３ 分别为 ５４、５７、５９、６６℃ ，反应
３０ ｓ， 共 ３０ 个 循 环； ＰＣＲ 反 应 体 系 ２５ μＬ： ２ × ＰＣＲ
菊 ［１０］ 和二月兰 ［１１］ 等多种作物叶斑病。 甘肃省农业科
学院植物保护研究所经济作物病害研究室于 ２０２０ 年
８ 月在甘肃省陇西县对黄芩病害调查时发现，叶斑病
的病田率达 ５０％，病株率达 ２０％ ～ ３５％。 田间大面积
黄芩叶片上普遍出现不规则的黑褐色病斑，扩展至整
收稿日期：２０２１⁃１１⁃０５ 接受日期：２０２２⁃０１⁃１５
株用打孔器切取直径为 ５ ｍｍ 的菌饼，菌丝面朝下、贴
３０ ｓ，７２℃ 延伸 ４５ ｓ，７２℃ 补充延伸 ５ ｍｉｎ， 退火温度
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２ ５ μＬ，ＤＮＡ １ μＬ，正反向引物各 １ μＬ，
ｄｄＨ ２ Ｏ ９ ５ μＬ。
制备 １ ２％ 琼 脂 糖 凝 胶，１２０ Ｖ 电 泳 ３０ ｍｉｎ，０ ５
基金项目：甘肃省农业科学院科研条件建设及成果转化项目（ ２０２０ＧＡＡＳ２５，２０２０ＧＡＡＳ３８） ，国家重点研发计划（ ２０１８ＹＦＤ０２０１１００） ，甘肃省科技
计划项目（２０ＹＦ３ＮＡ０２１）
作者简介：蒋晶晶，女，助理研究员，主要从事经济作物病害研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｊｉｎｇｚｉｙｕ＠ １６３．ｃｏｍ
ｍｇ·Ｌ
－１
ＥＢ 溶液中染色 １０ ｍｉｎ，置于 Ｇｅｌ． Ｄｏｃ ２０００ 型
凝胶成像仪（ 美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司） 进行拍照保存。 将具
特异性条带 ＰＣＲ 产物送上海生工生物工程有限公司
测序，所测序列与 ＮＣＢＩ 的 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中已知核
酸序列进行相似性比较。 采用 ＤＮＡＭＡＮ ７ 软件对核
物。 从药用植物学角度，黄芩分为根、茎叶、种子和种
（ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋｕｈｎ．） 引起的茎基腐病和灰葡萄孢
（ Ｌａｂｉａｔａｅ） 黄芩属（ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ） 植物，是多年生草本植
壳四个部位，主要有效成分为黄酮类化合物，具有清热
燥湿、泻火解毒、抗炎、抗肿瘤等药理作用。 黄芩广泛
摘 要：为探究黄芩叶斑病的病原种类，筛选有效的杀菌剂，本研究从甘肃省定西市陇西县黄芩主产区采
集黄芩叶斑病病叶，采用组织分离法进行病原物的分离，通过病原菌的形态特征并结合 ｒＤＮＡ 转录间隔
区（ ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ） 、过敏原基因（ Ａｌｔ ａ１） 、质膜腺苷三磷酸基因（ ＡＴＰａｓｅ） 和组蛋白基因（ Ｈｉｓ ３）４ 个基因序列
１ ３ １ 纯培养特征 用灭菌打孔器在菌落边缘打出
菌株重复 ３ 次，２５℃ 黑暗条件下培养 ７ ｄ 后观察记录
１ １ 试验材料
菌落形态和颜色等特征。
１ １ １ 样品采集 于 ２０２０ 年 ８ 月在甘肃省陇西县黄
１ ３ ２ 分生孢子形态观察和鉴定 将菌饼分别接种
集，每个地区随机选取 ３ ～ ５ 块田进行病叶调查和采
格孢（ Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ） 均有较好的抑菌作用，ＥＣ ５０ 分别为 ０ ０６ 和 ０ ０４ ｍｇ·Ｌ －１ 。 本研究在国内首次报道了
茄链格孢（ Ａ． ｓｏｌａｎｉ） 和细极链格孢（ Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ） 是引起黄芩叶斑病的病原菌，可为科学诊断该病害、研
究其发生规律和田间防治提供理论基础和科学依据。
Ａｌｔ－Ｆ
ＡＴＧＣＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣ
ＩＴＳ４
Ａｌｔ－Ｒ
质膜腺苷三磷酸 ＡＴＰａｓｅ 序列
Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＡＴＰａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
组蛋白序列
Ｈｉｓｔｏｎｅ ３（ Ｈｉｓ ３）
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
ＡＴＰＤＦ１
ＡＴＰＤＲ１
ＨＩＳ３－Ｆ
ＨＩＳ３－Ｒ
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ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡ ＡＴＧＣ
ＡＣＧＡＧＧＧＴＧＡＹＧＴＡＧＧＣＧＴＣ
ＡＴＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＴＣＧ
ＴＣＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＡＴＡＧＣＣ
ＡＣＴＡＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＧＧ
毒 ４０ ｓ，无菌水冲洗 ２ 次后置于灭菌滤纸上晾干。 将
病组织块接种于 ＰＤＡ 培养基上，每皿 ４ 块，置 ２５℃ 恒
温培养箱中黑暗培养 ４ ｄ，待长出菌落后挑取菌落边缘
菌丝进行纯化，并转接至 ＰＤＡ 斜面，４℃ 保存备用。
田间防治提供理论依据。
１ ３ 病原菌形态鉴定
１ 材料与方法
直径 ５ ｍｍ 的菌饼，接种在 ＰＤＡ 培养基的中央，每个
黄芩具有产量高、品质佳、功效好等优势。 近年来，由
生在 植 物 上， 可 引 起 莴 笋 ［７］ 、 樱 桃 ［８］ 、 枸 杞 ［９］ 、 甜 叶
亚
［１］
。 在我国，黄芩主产于甘肃、陕西、山西等省
（ Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｓｐ．） 引 起 的 白 粉 病 ［４］ 、 立 枯 丝 核 菌
［２］
其中甘肃省定西市作为道地黄芩主产区之一，生产的
９７％ 咯菌 腈 （ Ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ） 原 药 （ 河 北 冠 龙 农 化 有 限
公司） 。
（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ， ＣＴＡＢ） 法［１６］ 提 取 菌
列（ＩＴＳ） ［１７］ 、过敏原基因（ Ａｌｔ ａ１） ［１８］ 、质膜腺苷三磷酸
基因（ＡＴＰａｓｅ） ［１９］ 、组蛋白基因（Ｈｉｓ ３）进行 ＰＣＲ 扩增，引
徐美蓉５，∗ 漆永红１，∗
（ １ 甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州 ７３００７０；２ 甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州 ７３００７０；
３
定西市植保植检站，甘肃 定西 ７４３０００；４ 甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃 兰州 ７３００７０；
５
甘肃省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，甘肃 兰州 ７３００７０）
于市场需求量的增加，黄芩种植面积逐步扩大，生产上
连年种植，导致黄芩病害出现明显加重的趋势。 目前，
国内外已报道的黄芩病害和其病原种类为：由镰孢属
（ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．） 引 起 的 根 腐 病
［３］
、北方根结线虫
（ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ） 引起的根结线虫病、 齐整小核菌
世界已描述的链格孢种有约 ５００ 个，其中 ９５％ 以上寄
分布于 温 带 和 热 带 山 脉 地 区， 遍 及 欧 洲、 北 美 和 东
（ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐｅｒｓ．） 引起的灰霉病 ［５］ 等， 但引起黄
芩叶斑病的病原菌相关研究仍鲜见报道。
链格孢属（ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐ．） 是一种极为常见的病原
，
菌，具有适应强、寄主范围广、为害严重等特点 ［６］ 。 全
∗
通讯作者：徐美蓉，女，实验师，主要从事农产品质量安全与农药残留分析研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｘｕｍｅｉｒｏｎｇ＠ ｇｓａｇｒ．ａｃ．ｃｎ；
漆永红，男，副研究员，主要从事经济作物病害研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｑｉｙｏｎｇｈｏｎｇ９２０＠ ｇｓａｇｒ．ａｃ．ｃｎ。 同为通讯作者。
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关键词：黄芩； 叶斑病； 细极链格孢； 茄链格孢； 毒力测定
ＤＯＩ：１０ １１８６９ ／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００⁃８５５１ ２０２２ １１ ２１６６
黄 芩 （ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ ） 为 唇 形 科
（ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ Ｓａｃｃ．） 引 起 的 叶 枯 病、 白 粉 菌 属
１１ 期
２１６７
黄芩叶斑病病原菌鉴定和药剂室内毒力测定
个叶面，导致叶片发黄，枯萎；植株光合作用严重受阻，
１ ２ 病原菌分离和纯化
造成巨大的经济损失，严重影响黄芩的产量和品质。
采用常规组织分离法 ［１２－１３］ 进行病原菌分离。 选
择具有典型叶斑病症状的叶片，剪病健交界处 ５ ｍｍ ×
因此，本试验采用组织分离法对黄芩叶斑病的病原菌
纸浸湿，后置于 ２５℃ 生化培养箱，保湿并在 １２ ｈ 光照 ／
１２ ｈ 黑暗交替下培养 ５ ～ ９ ｄ 后在光学显微镜下拍照。
１ ４ 病原菌基因组 ＤＮＡ 提取及多基因分子生物学鉴定
将菌株接种在铺有灭菌玻璃纸的 ＰＤＡ 平板上进行
供试药剂：０ ３％ 丁子 香 酚 可 溶 液 剂 （ 保 定 市 亚
培养，５ ｄ 后 收 集 菌 丝，采 用 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵
剂（ 杨凌馥 稷 生 物 科 技 有 限 公 司 ） 、 ９８ ５％ 腐 霉 利
株基因组 ＤＮＡ。 将提取的 ＤＮＡ 用核糖体转录间隔区序
达益农农业科技有限公司） 、０ ４％ 蛇床 子 素 可 溶 液
（ Ｐｒｏｃｙｍｉｄｏｎｅ） 原 药 （ 江 西 禾 益 化 工 有 限 公 司 ） 、
核 农 学 报 ２０２２，３６（１１） ：２１６６ ～ ２１７４
２１６６
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０２２）１１⁃２１６６⁃０９
黄芩叶斑病病原菌鉴定和药剂室内毒力测定
蒋晶晶１ 赵娇娇２ 陈爱昌３ 曹素芳４ 李继平１ 李青青１
进行分离，柯赫氏法则进行致病性测定，结合形态学和
分子生物学手段对病原菌进行鉴定，旨在明确该病害
的病原菌种类，为科学诊断和研究病害发生规律提供
科学依据；同时，室内测定了 ４ 种杀菌剂对病原菌的毒
力，以期筛选出高效、低毒、低残留的药剂，为该病害的
５ ｍｍ 的病组织，用 １％次氯酸钠消毒 ４０ ｓ，７５％酒精消
养 １０ ｄ 后观察产孢情况。 将产生的分生孢子用无菌水冲
芩主产区福星镇、首阳镇、菜子镇和文峰镇进行样品采
集，共获得 ３８ 份病叶，及时带回甘肃省农业科学院植
物保护研究所经济作物病害研究室进行病原菌分离。
１ １ ２ 供 试 培 养 基 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 （ ｐｏｔａｔｏ
ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基：马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ；
对病原菌进行种类鉴定，采用菌丝生长速率法测定 ４ 种杀菌剂对病原菌的抑菌作用。 结果表明，引起陇
西县黄芩叶斑病的病原菌为茄链格孢（ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ） 和细极链格孢（ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ） ，其中细极
链格孢为优势病原菌；室内毒力测定表明，９７％咯菌腈的抑菌作用最强，对茄链格孢（ Ａ． ｓｏｌａｎｉ） 和细极链
加入琼脂 １４ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ，１２１℃灭菌备用。
１ １ ３ 供试材料 供试菌株：茄链格孢（ Ａ． ｓｏｌａｎｉ） 和
细极链格孢（ Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ） 。
至 ＰＤＡ、ＰＣＡ、ＣＭＡ 和 ＳＡ 培养基中央，１８℃ 恒温黑暗培
洗，在光学显微镜下对链格孢的分生孢子大小、颜色、产
马铃薯胡萝卜琼脂（ｐｏｔａｔｏ ｃａｒｒｏｔ ａｇａｒ，ＰＣＡ） 培养基：马
铃薯 ２０ ｇ、胡萝卜 ２０ ｇ；玉米粉（ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ａｇａｒ，ＣＭＡ）培
养基：玉米粉 ３００ ｇ、琼脂 １４ ｇ；蔗糖碳酸钙（ｓｕｃｒｏｓｅ ＣａＣＯ３
ａｇａｒ，ＳＡ）培养基：蔗糖 ２０ ｇ、碳酸钙 ３０ ｇ。 以上培养基均
物（表 １）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表 １ 引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＩＴＳ 序列
ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
过敏原 Ａｌｔ ａ１ 序列
Ａｌｌｅｒｇｅｎ Ａｌｔ ａ１ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
目标基因
Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
ＩＴＳ１
ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ
生的横隔、纵隔数进行统计，参考张天宇［１４］ 和 Ｓｉｍｍｏｎｓ
等［１５］ 对链格孢属种的描述来鉴定病原菌的种类。
１ ３ ３ 产孢表型观察 将滤纸剪成比载玻片小的长方
形，并在滤纸中间剪约 １ ｃｍ × ２ ｃｍ 的孔，将其置于载玻
片上，放入培养皿内湿热灭菌后备用。 从菌落边缘取适
量菌丝和孢子均匀涂抹在小孔一侧，加适量无菌水将滤