脊髓损伤后血管内皮生长因子的表达及细胞凋亡

脊髓损伤后血管内皮生长因子的表达及细胞凋亡
林斌;何永志;黄其龙;卢志有
【摘要】目的观察大鼠急性脊髓损伤后不同时间点血管内皮生长因子(VEGF)的表达及局部脊髓组织细胞凋亡的情况,进一步了解脊髓损伤后的病理变化情况.方法雌性SD大鼠,随机分为对照组(A组)、脊髓损伤组(B组),每组各30只.所有大鼠行
T12节段椎板切除开窗,暴露脊髓.A组只打开椎板,不打击脊髓.B组按改良Allen法(以10 g×6 cm力撞击脊髓)制作大鼠急性脊髓损伤模型.各组分别于伤后1、3、5、7、14、28 d随机处死5只,损伤部位取材,VEGF、细胞凋亡免疫组化染色及在光
镜下观察,计算VEGF阳性细胞数及凋亡细胞数.结果 A组脊髓中央管周围和脊髓软脊膜见少量VEGF表达,其它部位未见表达;B组脊髓损伤后VEGF在脊髓损伤及损
伤周边区高表达,5 d达高峰,7 d和14 d表达仍较明显,28 d见少量表达;B组各时
间点VEGF表达和A组相比差异均有统计学意义(P<0.05).A组各时间点凋亡细胞
少见,B组则较明显,凋亡细胞在脊髓损伤后逐渐增多,1 d达高峰,3 d和5 d仍较多,7、14、28 d仍有表达;B组各时间点细胞凋亡和A组相比差异均有统计学意义(P<0.05).结论 VEGF参与急性脊髓损伤后系列病理改变,且持续时间较长.急性脊髓损伤后较长时间内存在着继发性细胞凋亡现象.%Objective To observe the expression level of vascular endothelial growth factor ( VEGF ) and cells apoptosis at different time points after rats suffering acute spinal cord injury, further in-depth understanding of the pathological changes after spinal cord injury. Methods Female SD rats, which were randomly divided into control group ( A group ), spinal cord injury group ( B group ), with 30 animals in each group. The 60 rats were surgically removed the vertebral lamina of T12 segment to expose the spinal cord. And then in A group, the
spinal cord was untouched; in B group, the spinal cord was hit by power of 10 g × 6 cm according to the improved Allen's method to establi sh rat acute spinal cord injury model, then 5 randomly selected rats were sacrificed at 1,3,5,7,14,28 d after injury, materials were obtained from the injury locations following by immunohistochemical staining( IHC ) of cell apoptosis and VEGF, observation and calculation of the VEGF positive cells and the positive apoptosis cells under light microscope. Results Except that a few VEGF expressed around central canal and soft meninges of spinal cord, it seldomly expressed in other locations in sham group; In control group, after spinal cord injury VEGF highly expressed in the injured area and its periphery, which reached the peak at 5 d, decreased after 5 d, obviously expressed at 7,14 d and still expressed at 28 d. The expression of VEGF significantly increased at 1,3,5,7,14, 28 d compared to control group, and the difference was significant ( P <0. 05 ). A little TUNEL labeled positive cells were observed at every time point in sham group, while those cells could be observed obviously after spinal cord injury in the control and intervention groups. Apoptotic cells gradually increased after injury, reached the peak at 1 d, decreased after that. At 5, 7 d time points there were still many apoptotic cells and still existed at 14, 28 d. The apoptotic cells increased at 1,3,5,7, 14,28 d compared to control group, and the difference was significant ( P <0. 05 ). Conclusions VEGF plays a part in the pathological change after spinal cord injury, and it persists a long time. Secondary neuron apoptosis exist for a long time after SCI.
【期刊名称】《临床骨科杂志》
【年(卷),期】2013(016)001
【总页数】3页(P79-81)
【关键词】脊髓损伤;血管内皮生长因子;细胞凋亡
【作者】林斌;何永志;黄其龙;卢志有
【作者单位】解放军第175医院骨科医院,福建,漳州,363000;解放军第175医院骨科医院,福建,漳州,363000;解放军第175医院骨科医院,福建,漳州,363000;解放军第175医院骨科医院,福建,漳州,363000
【正文语种】中文
【中图分类】R683.2;R345.1;R329.3
脊髓损伤是严重危害人类健康的疾病，多项研究证实，脊髓损伤后神经元及神经胶质细胞的死亡大部分属细胞凋亡的结果［1］。

脊髓神经细胞死亡并非均由脊髓的直接损伤所致，而是和脊髓损伤后的细胞凋亡有密切相关［2］。

研究发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)既可改善微循环、促进血管内皮修复及新血管生成，又可抑制细胞凋亡并刺激神经再生，是一种独立的神经保护因子［3］。

本实验对大鼠急性脊髓损伤后血管内皮生长因子和细胞凋亡的系列变化进行观察。

1 材料与方法
1．1 实验动物分组及方法成年SD清洁大鼠60只(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，雌性，体重250～300 g。

适应性饲养1～2周。

随机分为:①对照组(A 组):30只，仅行椎板切除，不损伤脊髓。

②脊髓损伤组(B组):30只，椎板切除后
采用改良Allen重量打击法(以10 g×6 cm力撞击脊髓)制作T12脊髓损伤模型，
以双下肢出现应激反射视为打击成功，评估脊髓撞击试验的可信度。

术后将大鼠单笼饲养观察，空调和换气扇持续保持室内恒温和通风，每天护理观察并保持大鼠笼干燥、清洁。

术后人工大鼠膀胱按摩(q 8 h)，以协助大鼠排尿，防止术后尿潴留，用电吹风机保证瘫痪以下的皮肤、皮毛干燥。

观察皮肤有无压疮或感染等。

术后给注射用青霉素钠粉针剂104U bid×3 d，预防感染。

1．2 组织学观察两组于脊髓损伤术后1、3、5、7、14、28 d分别随机处死5只大鼠，取其脊髓标本进行VEGF、细胞凋亡免疫组化染色。

免疫组化染色结果计算:每只大鼠取5张切片，每张切片随机选取10个不重叠视野(400倍)光镜下记录阳
性细胞数。

其中细胞质为棕褐色均染或颗粒判为VEGF阳性细胞，细胞核呈黄褐色，核内可见棕黄色颗粒状沉淀物判为凋亡阳性细胞。

1．3 统计学处理采用SPSS 16．0软件对实验结果进行统计学分析，数据以±s
表示。

各组组内VEGF阳性细胞数和凋亡阳性细胞数采用单因素方差分析;不同组
之间相同时间点的比较采用两独立样本的t检验。

2 结果
2．1 VEGF免疫组化染色结果在光学显微镜下观察，组织切片上的细胞质中有棕
褐色颗粒者为阳性细胞。

A组:脊髓中央管周围可见少量VEGF免疫阳性细胞，而
其它部位几乎不表达。

B组:1 d VEGF出现表达，主要在大鼠脊髓损伤区及损伤周边区(图1)，而脊髓损伤区的VEGF表达高于损伤周围区，5 d达到高峰，7 d和
14 d表达仍较明显，28 d仍可见表达(图2)。

B组与A组各时间点VEGF的表达
比较有统计学意义(P＜0．05)，见表1。

2．2 TUNEL标记阳性细胞凋亡结果在光学显微镜下观察，组织切片上细胞核中
有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。

A组各时间点基本未见凋亡细胞。

B组1 d即出现明显的细胞凋亡(图3)，3 d和5 d持续较高，28 d时仍可见凋亡细胞，
主要见于白质，且高于A组(图4)。

B组与A组各个时间点凋亡细胞数比较差异有统计学意义(P＜0．05)。

3 讨论
3．1 脊髓损伤后细胞凋亡的表达脊髓损伤后细胞有坏死和凋亡两种死亡方式，细胞凋亡是继发性脊髓损伤的重要组成部分。

本实验发现，B组细胞凋亡数在脊髓损伤后1 d达高峰，3～5 d仍持续较多，7 d明显减少，14 d和28 d仍有凋亡细胞，且和A组比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。

说明脊髓损伤后神经细胞存在凋亡的时间较长，细胞凋亡在相当长的一段时间内对脊髓损伤后继发性脊髓损伤起重要的影响作用。

笔者认为，如能在脊髓损伤早期阻止细胞的凋亡，并在脊髓损伤后期持续有效地抑制或减少细胞凋亡，将会是治疗脊髓损伤的有效途径。

表1 两组术后不同时间VEGF免疫阳性细胞数(n=5，个，±s)与A组比较:*P＜0．05组别术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d 术后14 d 术后28 d A 3．66 ±0．03 3．66 ±0．01 3．66 ±0．04 3．66 ±0．08 3．66 ±0．01 3．66
±0．02 B 53．89 ±1．87* 61．35 ±1．89* 67．11 ±3．03* 59．75 ±1．30* 30．51 ±0．85* 20．08 ±0．35*
表2 两组术后不同时间点的凋亡细胞数(n=5，个，±s)与A组比较:*P＜0．05组别术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d 术后14 d 术后28 d A 15．30 ±0．32 15．08 ±0．63 15．03 ±0．40 15．11 ±0．42 15．08 ±0．42 15．13
±0．59 B 65．48 ±4．03* 49．14 ±2．86* 32．80 ±2．34* 25．04 ±0．83* 21．92 ±0．65* 21．39 ±0．59*
图1 、2 脊髓损伤组损伤后1 d(图1)、28 d(图2)VEGF免疫组化染色结果，细胞质中有棕褐色颗粒者(箭头所指)为阳性细胞×400 图3、4 脊髓损伤组在损伤后1 d(图3)、28 d(图4)TUNEL标记阳性细胞凋亡结果，细胞核中有棕黄色颗粒者(箭头所指)为阳性细胞(即凋亡细胞) ×400
3．2 脊髓损伤后VEGF的表达 VEGF的表达及生成受许多因素调节，最新研究［4］发现，缺氧是迄今所发现的对VEGF影响最强的因素，而且VEGF对缺氧的应答存在负反馈调节机制。

体内外实验均证实了VEGF在缺氧时会发生高表达
［5-6］。

本实验证实，B组VEGF的表达明显高于A组，这可能和缺氧、炎症因子上调VEGF的表达有关。

B组脊髓损伤后28 d VEGF的表达仍明显高于A组，
提示在脊髓损伤后相当长的一段时间内，受损伤的脊髓内可能一直存在着缺氧的状态，虽然这种状态的持续存在负反馈上调了VEGF的表达，对脊髓神经起保护作用，但是缺氧同时也直接导致了脊髓神经生化机制的异常，影响脊髓损伤后的修复。

因此笔者认为，如果在急性脊髓损伤后能有效地人工干预并调节VEGF的表达，
发挥VEGF在脊髓损伤时独立的神经保护作用，这将为脊髓损伤后续治疗提供一
种新的思路。

3．3 展望目前VEGF表达的机制尚不清楚，而根据VEGF的生物学特性，以后研究的热点除了研究并掌握降纤酶提高VEGF表达的机制外，还可集中在如何掌握
其量的表达调控，并针对性地通过抑制或激活控制其量的表达，从而更加精准地在合适的时期上调或降低VEGF的表达，以达到其在脊髓损伤中治疗的作用。

参考文献:
［1］ Jin H W，Ichikawa H，Nomura K，et al．Activation of the caspase cascade underlies the rat trigeminal primary neuronal apoptosis induced
by neonatal capsaicin administration［J］．Arch Histol Cytol，2005，
68(4):301-310．
［2］汪红林，徐祝军．脊髓损伤后细胞凋亡基因调控研究进展［J］．国际骨科
学杂志，2010，(3):187-189．
［3］ Almodovar C R，Lambrechts D，Mazzone M，et al．Role and therapeutic potential of VEGF in the nervous system［J］．Physiol Rev，
2009，89(2):607-648．
［4］巩沅鑫，周其全．低氧暴露下血管内皮生长因子高表达与血脑屏障通透性改变的关系［J］．中国微循环，2009，10(1):66-69．
［5］ Hayashi T，Abe K，Suzuki H，et al．Rapid induction of vascular endothelial growth factor gene expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats［J］．Stroke，1997，28(10):2039-2044．
［6］ Slevin M，Krupinski J，Slowik A，et al．Activation of MAP
kinase(ERK-1/ERK-2)，tyrosine kinase and VEGF in the human brain following acute ischaemic stroke［J］．Neuroreport，2000，11(12):2759-2764．。