血红蛋白HbA2与HbF免疫学检测体系的建立与初步应用（1）

南方医科大学２０１２级硕士学位论文血红蛋白ＨｂＡ２与ＨｂＦ免疫学检测体系的建立与初步应用ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆＥＬＩＳＡｆｏｒＨｂＡ２ａｎｄＨｂＦ课题来源：广东省科技计划项目２００７８０３１５１２００１专业名称免疫学学位申请人李雪丽指导教师富宁教授刘艳君副教授答辩委员会主席吴玉章教授（第三军医大学）答辩委员会成员吴长有教授（中山大学）郑利民教授（中山大学）陈政良教授（南方医科大学）车小燕教授（南方医科大学）论文评阅人邱晓彦教授（北京大学）董文其教授（南方医科大学）２０１２年４月１３日硕士学位论文血红蛋白ＨｂＡ２与ＨｂＦ免疫学检测体系的建立与初步应用硕士研究生ｔ李雪丽指导教师：富宁教授刘艳君副教授摘要人类血红蛋白链可分为ａ链（伐，０与非ａ链（ｐ，丫，６，￡）。

正常成人血红蛋白的主要成份是血红蛋白Ａ（ＨｂＡ），占全部血红蛋白的９６．５－＿９７．５％，由一对ａ链及一对Ｄ链（ａ２１３２）构成；其余成分为血红蛋白Ａ２（ＨｂＡ２），由ａ２｛ｉ２构成，占２．孓＿３．５％，而胎儿血红蛋白ＯＰＨｂＦ（ａ２ｙ２），占ｌ％以下。

在一些血液系统疾病中，包括ａ与ｐ地中海贫血及其基因携带者的血红蛋白比例有所改变。

·Ｄ地中海贫血（以下简称ｐ地贫）是由于Ｄ珠蛋白基因缺陷导致Ｄ珠蛋白链合成减少或缺如所引起的遗传性血液病，其典型的临床表现是小细胞低色素性贫血〔１．３】。

该病广泛分布于世界许多地区，东南亚是高发区之一，在我国南方地区如广东、广西、海南的发病率和携带率都很高。

重症地贫发病率在广东省的出生缺陷中排位第二，以ｎ和Ｄ地贫基因携带率分别为８．５３％和２．５４％（合计达１１．０７％）估算，全省每年生育重症Ｑ地贫（Ｂａｒｔ‟ｓ水肿胎和ＨｂＨ病）和重症ｐ地贫患儿的高风险育龄夫妇可达４，０００对以上【１．５１。

重症Ｄ地贫患儿主要依靠频繁的输血维持生命，且多在未成年前天折，给社会和家庭在经济上和精神上带来沉重的负担。

因此，通过检测Ｄ地贫从而进行产前诊断是阻止该病重症患儿出生最为有效的措施。

产前诊断是目前国际上公认的预防地贫的首选措施。

通过产前诊断可有效预防患儿的出生，从而达到预防重症地贫患儿出生的目的。

在人群中大规模筛中文摘要查ｐ地贫基因携带者是实现地贫预防的必要步骤。

基于中国南方ｐ地贫发生的人群高频率，开展大规模遗传病群体预防具有重要意义。

广大的育龄期青年和孕期夫妇可作为人群筛查的主要对象。

传统用于检测ｐ地贫携带者的方法有表型筛查法和基因检测两大类。

表型筛查法主要是血液学检查和血红蛋白分析，如红细胞形态、红细胞指数、红细胞渗透脆性、血红蛋白理化性质测定、血红蛋白电泳等几个方面，但这些方法变异范围大、准确性低。

近年采用的高效液相色谱法，由于仪器设备昂贵，不适用于广大地贫高发区的高通量筛查。

基因检测法，是从样品的制备、目的基因的ＰＣＲ扩增、ＰＣＲ产物的鉴定和分析到反向点杂交实验（１ｍＢ）对地贫的基因分型。

用上述筛查后进行基因诊断确诊的分析策略是地贫诊断的传统技术路线【６．９】。

该方法准确、可靠，但操作过程较为繁杂，难以实现快速和高通量，且检测费用较高，不易在基层医院普及，从而限制了地贫基因携带者的大规模筛查。

因此研究和开发具有高通量、廉价、易于在基层使用的新技术势在必行。

ｐ地贫患者及基因携带者的Ｄ珠蛋白链合成障碍导致ＨｂＡ２水平发生改变，其外周血红细胞ＨｂＡ２含量可高出正常人一倍。

因此，ＨｂＡ２的免疫学检测可作为ｐ地贫的筛查指标；同时，ｐ地贫患者及其基因携带者外周ｆｉｎ中Ｈｂ
Ｆ亦普遍升高，因此ＨｂＦ定量可作为Ｂ地贫筛查的辅助指标，二者联合应用，可以完善对地贫的免疫学筛查、诊断及预后判断。

ＥＬＩＳＡ法具有特异性好、敏感度高、操作简便等优点，可进行高通量检测，适用于大规模筛查。

本科室在成功研制了检测ａ地贫免疫学试剂盒的基础上，又成功制备了可分别特异性识别ＨＭ屹、ＨｂＦ的单克隆抗体，可用于ｐ地贫的大规模筛查、辅助诊断以及Ｄ地贫患者的病情监测与预后判断。

据文献报道，胎儿血红蛋白作为一种胚胎期蛋白与恶性肿瘤有一定关联，在一些恶性肿瘤如儿童急性白血病、结肠癌、生殖细胞肿瘤中ＨｂＦ含量出现再次增高〔１０．１４〕，本文通过流式细胞术、ＰＣＲ技术、免疫组化的方法，检测肿瘤细胞中ＨｂＦ的表达情况。

Ｈ硕士学位论文第一章ＨｂＡ２免疫学检测体系的建立和优化在前期单抗的制备工作中，我们成功研制了４株血红蛋白单抗，其中２Ｈ４、１Ｈ１１特异性针对ＨｂＡ２，即Ｈｂ８链特异性；２Ｃ９、ＩＥｌ０则具有ＨｂＡ（Ｈｂｐ）、ＨｂＡ２双特异性。

通过交叉配对选择合适的抗体对，确定了以单抗２Ｈ４为捕获抗体，２Ｃ９为检测抗体并直接标记辣根过氧化物酶，进行了最佳工作浓度、反应时间及温度的选择与确定。

确定单抗２Ｈ４最佳包被浓度为２ｕｇ／ｍｌ，ＨＲＰ一２Ｃ９最佳检测浓度为ｌｐｇ／ｎ，ａ。

通过比较不同的血液标本保存条件、不同的封闭条件以及样品稀释液对体系的作用，同时对样品裂解缓冲液与裂解条件进行了摸索，对体系进一步优化。

经鉴定该体系可特异性结合ＨｂＡ２，而与ＨｂＡ、ＨｂＦ及Ｈｂｚｅｔａ链无交叉反应；其敏感度可达ｎｇ／ｍｌ水平，考虑临床应用的方便，我们降低了检出敏感性以减少稀释倍数高可能形成的误差。

所获ＨｂＡ２标准曲线拟合关系较好，能够特异、敏感地检测１３地贫基因携带者及正常人血中的ＨｂＡ２。

此外，我们还正在尝试用同样的双单抗建立时间分辨免疫荧光检测体系，以提高在一定浓度范围内的分辨率。

第二章ＨｂＦ双抗体夹心体系的建立和优化基于前期实验工作所获得的三株抗ＨｂＦ单抗与亲和纯化兔抗ＨｂＦ多克隆抗体进行组合，证明以单抗２Ｃ８作为捕获抗体相对其他单抗可获得更好的灵敏度，且本底也比较低。

同时，我们对单多抗双夹心ＥＬＩＳＡ的包被抗体浓度、检测抗体浓度、包被缓冲液、封闭液及样品稀释液等条件予以优化。

尤其是采用了不同于一般双夹心ＥＬＩＳＡ的“ｓ—ＨＣＩ（ｐＨ８．Ｏ）缓冲体系，而多数ＥＬＩＳＡ均采用ＰＢＳ体系。

同时对体系的特异性、灵敏度、检测范围及批间批内稳定性进行鉴定。

并用所确立条件初步测定了经高效液相色谱法检测的１００份外周血样品。

结果表明：本检测体系特异性好，与ＨｂＡ２和ＨｂＡ无交叉反应。

其检测灵敏度约为０．０３９ｕｇ／ｍｌ，检测范围０．０３９．２４．６６ｕｇ／ｍｌ，重复性好；１００份血标本的检测结果与ＨＰＬＣ的检测结果有良好的相关性。

中文摘要第三章Ｉ－ｌｂＦ在肿瘤细胞内表达的初步研究鉴于一些胚胎抗原可在若干肿瘤细胞及血清中表达，并由此被作为肿瘤相关抗原的标志物，我们以ＦＩＴＣ标记前期制备的ＨｂＦ单抗，用流式细胞术检测了１３种肿瘤细胞系（Ｋ５６２、ＨＬ６０等）中胎儿血红蛋白的表达情况。

同时提取肿瘤细胞系的ＲＮＡ，检测胎儿血红蛋白在基因水平的表达情况。

结果表明，除了Ｋ５６２细胞外，其余肿瘤细胞系均不表达胎儿血红蛋白。

Ｋ５６２是红．白血病细胞系，具有向红系或白系分化的趋势，因此，Ｋ５６２可表达胎儿血红蛋白；其他肿瘤细胞系，如血液系统的肿瘤细胞系ＨＬ．６０，及文献报道出现原代肿瘤细胞表达ＨｂＦ的生殖细胞肿瘤、肠道的恶性肿瘤，均未检出胎儿血红蛋白的表达。

原代肿瘤组织切片的免疫组化结果中，可在肝细胞肝癌、宫颈癌、腹膜Ｂ细胞淋巴瘤的肿瘤组织微血管内发现有ＨｂＦ表达阳性的细胞，但在肿瘤细胞和组织未能发现有ＨｂＦ表达。

关键词：ｐ地中海贫血ＨｂＡ２ＨｂＦ双夹心ＥＬＩＳＡＩＶ硕士学位论文ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆＥＬＩＳＡｆｏｒＨｂＡ２ａｎｄＨｂＦＮａｍｅ：ＬｉＸｕｅｌｉＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＦｕＮｉｎｇＬｉｕＹａｎｊｕｎＡＢＳＴＲＡＣＴＨｕｍａｎｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓａｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆｇｌｏｂｉｎｃｈａｉｎｓ，ｏｎｅｏｆｗｈｉｃｈｉｓａｃｈａｉｎ（ａ，０，ｏｔｈｅｒｉｓｎｏｎ－ａｃｈａｉｎｓ（１３，丫，６ｏｒ￡）．ＴｈｅｍａｉｎｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｎｎｏｒｍａｌａｄｕｌｔｉｓｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎＡ（ＨｂＡ，ｗｈｉｃｈｉｓｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄｏｆ２Ｇｔ－ｃｈａｉｎｓａｎｄ２１３－ｃｈａｉｎｓｉ，ｅａ２１３２ａｎｄａｃｃｏｕｎｔｓｆｏｒ９６．５—９７．５％ｏｆｔｈｅｗｈｏｌｅｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ，ａｎｏｔｈｅｒｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｓｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎＡ２（ＨｂＡ２），ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄｂｙｔｈｅａ２６２，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇｆｏｒ２．５·３．５％ｏｆｔｈｅｗｈｏｌｅｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ，ａｎｄｔｈｅｌａｓｔｏｎｅｉｓｆｅｔａｌｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＦ，ａ２７２），ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇｆｏｒｌｅｓｓｔｈａｎｌ％ｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ．ＴｈｅａｂｎｏｒｍａｌｒａｔｉｏｏｆｔｈｅｇｌｏｂｉｎｃｈａｉｎｓＣａｎｈａｐｐｅｎｉｎｓｏｍｅｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｓｕｃｈａｓａａｎｄＤ．ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａａｎｄｔｈｅｉｒｇｅｎｅｃａｒｒｉｅｒｓ．１３ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａａｓａｓｅｒｉｏｕｓｍｏｎｏｇｅｎｉｃｉｎｈｅｉｒｅｄｄｉｓｏｒｄｅｒｗｉｔｈ１３ｇｌｏｂｉｎｇｅｎｅｄｅｆｅｃｔｓＣａｎｍａｎｉｆｅｓｔｌｏｗｐｉｇｍｅｎｔａｎａｅｍｉａ【ｌ－３】，ｗｈｉｃｈｉｓｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｍａｎｙｐａｒｔｓｏｆｔｈｅｗｏｒｌｄｉｎｃｌｕｉｎｇＳｏｕｔｈｅａｓｔＡｓｉａ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｓｏｕｔｈｅｒｎＣｈｉｎａ，ｓｕｃｈａｓＧｕａｎｇｘｉ，ＨａｉｎａｎａｎｄＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ．ＴｈｅｖｅｒｙｈｉｇｈｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｃａｒｒｉｅｒｓｗｉｔｈｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｉｎｓｏｕｔｈｅｒｎＣｈｉｎａｌｅａｄｓｔｏｓｅｒｉｏｕｓｂｉｒｔｈｄｅｆｉｅｃｅｎｃｙ，ａｎｄｓｅｒｉｏｕｓａｎｅｍｉａｅｖｅｎｅａｓｉｌｙｄｉｅｂｅｆｏｒｅａｄｕｌｔ【ｌ·５】．Ｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｗａｙｔｏｐｒｅｖｅｎｔｔｈｅｂｉｒｔｈｏｆ１３ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｉｎｆａｎｔｉｓｔｏｐｅｒｆｏｒｍＡＢＳＴＲＡＣＴｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｎｗｈｉｃｈｂｏｔｈｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍａｎａｎｄｈｅｒｈｕｓｂａｎｄｓｈｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｒｕｒｇｅｎｔｌｙｓｔｒａｔｅｇｙｗｏｕｌｄｂｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｐｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｃａｒｒｉｅｒｓｆｒｏｍｐｅｏ
ｐｌｅｉｎｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｇｅ，ｓｉｎｃｅｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓ、析ｔｌｌ１３ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｉｓｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｆｒｏｍｔｗｏｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｅｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｆｅｘｐｅｎｓｉｖｅｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓｏｒｓｐｅｃｉａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｕｌｄｂｅａｐｐｌｉｃａｔｅｄｉｎｌｌｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｉｎｇｅｎｅｒａｌ，ｔｈｅｒｅａｒｅｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｔｈａｌａｓｓｅ咄ｗｈｉｃｈａｒｅｔｈｅｇｅｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｔｈｅｇｅｎｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｉｓａｇｏｌｄｅｎｓｔａｎｄａｒｄｆｏｒｉｎｈｅｒｉｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｃａｒｒｉｅｒｓ【６－９】，ｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄｓｋｉｌｌ，ｅｑｕｉｐｍｅｎｔａｎｄｑｕａｌｉｔｉｏｎｓｈｏｕｌｄｒｅｑｕｉｒｅｄ．Ｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒ１３ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｉｎｃｌｕｄｅｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｏｆＨｂＡ２ａｎｄＨｂＦ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｆＨｂＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｒｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｂｏｔｈｏｆＨｂＡ２ａｎｄＨｂＦａｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ），ｗｈｉｃｈｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｆｏｒｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｕｓｅｄｉｎｃｏｍｍｏｎｈｏｓｐｉｔａｌｉｎｓｍａｌｌｔｏｗｎｏｒｃｏｕｎｔｒｙｓｉｄｅ，ａｎｄｉｓｎｏｔｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｒａｔｈｅｒｕｒｇｅｎｔｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｔｈａｔｓｈｏｕｌｄｂｅｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔａｎｄｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｈｉｇｈｔｈｒｏｕｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ａｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＬＩＳＡｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓｖｅｒｙｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔＩｌＨＰＬＣａｎｄｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｗｅｈａｖｅｔｒｉｅｄｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅＨｂＡ２ａｎｄＩ－ＩｂＦｌｅｖｅｌｉｎｈｅｍｏｌｙｓａｔｅｓｆｒｏｍｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｍＡｂｓｓｐｅｃｉｆｉｃｔｏＩ－ＩｂＡ２ａｎｄＨｂＦ，ａｎｄｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨｂＥＩｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｗｅａｌｓｏｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨｂＦｉｎ１３ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．ＰａｒｔＩ．ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
ｏｆＨｂＡ２硕士学位论文Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｒｎＡｂｓ）ａｇａｉｎｓｔＩ－ｌｂＡ２ｉｎｏｕｒｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｗｏｒｋ，ａｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨｂＡ２ｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｂｙｃｒｏｓｓ·ｐａｉｒｓｏｆ４ｓｔｒａｉｎｓｍＡｂｓｆｏｒＨｂＡ２，ｍＡｂｓ２Ｈ４ａｎｄ１ＨＩ１ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｏＨｂ５ｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｃａｐｔｕｒｅａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｄｍＡｂ２Ｃ９ｗｉｔｌｌｒｅａｃｔｉｏｎｔｏＨｂ５ａｎｄＨｂｌ３ＷａｓｕｓｅｄａｓｄｅｔｅｃｔｏｒａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｗｉｔｌｌＨＲＰ．ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃａｐｔｕｒｅａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，ｃｏａｔｉｎｇａｎｄｂｌｏｃｋｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｔｉｍｅｅｔｃ．Ｆｉｎａｌｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｃｉｔｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨｂＡ２ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｐｒｏｖｅｄ．ＴｈｉｓｓｙｓｔｅｍｃａｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅＨｂＡ２ｓｐｅｉｃｉｆｉｃａｌｌｙ，ａｎｄｗｉｔｈｏｍａｎｙｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｏｎｔｏＨｂＡ，ＨｂＦａｎｄＨｂｚｅｔａ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｉｓｖｅｒｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｄｅｔｅｃｔａｂｏｕｔ２０ｎｇ／ｍｌＨｂＡ２，ｍｕｃｈｍｏｒｅｔｈａｎｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｏｆＨｂＡ２ｉｎｂｌｏｏｄ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｗｅｈａｖｅｔｏｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｉｎｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｄｕｅｔｏｈｉｇｌｌｄｉｌｕｔｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓ．Ｎｏｗ，ｔｈｉｓＥＬＩＳＡｓｙｓｔｅｍｓｔｉｌｌｒｅｑｕｉｒｅｔｏｉｍｐｒｏｖｅａｎｄｏｐｔｉｍａｌｉｚｅｓｏｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｍｏｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ，ｈｅｍｏｌｙｓｉｓｔｉｍｅａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｓｗｅｌｌａｓｓｔｏｒａｇｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅ，ｗｈｉｃｈｗｏｕｌｄｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｆｉｄｅｌｉｔｙｏｆｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．ＰａｒｔＩＩ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉ铮?ａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｓｙｓｔｅｍｆｏｒＨｂＦ．Ｂａｓｅｄｏｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｔｅｓｔｏｆ３ｓｔｒａｉｎｓｍＡｂｓｗｉｔｈｒａｂｂｉｔａｎｔｉ－ＨｂＦｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｔｈｅｍＡｂ２Ｃ８Ｗａｓｐｒｏｖｅｄａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｃａｐｔｕｒｅａｎｔｉｂｏｄｙ．ＷｅａｌｓｏｈａｖｅｏｐｔｉｍａｌｉｚｅｄｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｉｓｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｓｙｓｔｅｍ，ｓｕｃｈａ
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１ｆＩＩ】ｉｉｉ
ｉ．．．．．．．．．．．…．…．．．………．…．．．．．．…．…．．．．．．．．．．…．．．．．．．．．…．．…．．……．．…．．．．……．．．．．．．．．．．…．．．．．．．第一章ＨｂＡ２免疫学检测体系的建立和优化………………………．４１．１材料与方法……………………………………………………………………４１．２结果…………………………………………………………………………………………………一８１．３讨论…………………………………………………………………………………………………１４第二章ＨｂＦ双抗体夹心体系的建立优化及应用………………………１７２．１材料与方法…………………………………………………………………ｌ７２．２结果…………………………………………………………………………………………………２０２．３讨论………………………………………………………………………………………………．２４第三章，ｑＯＪＬ血红蛋白肿瘤细胞内表达的初步研究………………２６３．１材料与方法……………………………………………………………………２６３．２结果…………………………………………………………………………………………………３０３．３讨论…………………………………………………………………………………………………３６全文总结…………………………………………………………………………。

３８参考文献………………………………………………………………………。

３９中英文缩略词……………………………………………………………．．４３在读期间发表的文章…………………………………………………………．．４４致谢………………………………………………………………………………………………………４５ｉ目录学位论文原创性声明…………………………………………………………．．４６统计学审稿证明………………………………………………………………．４７硕士学位论文前言地中海贫血于１９２５年Ｉ扫Ｃｏｏｌｅｙ和Ｌｅｅ首先描述，最早在意大利、希腊和其他地中海区域的民族及其移民的后裔中发现此病，所以叫“地中海贫血”，国外亦称海洋性贫血。

本病以地中海地区、中非洲、亚洲、南太平洋地区发病较多。

这类疾病由于常染色体遗传性缺陷，引起珠蛋白链合成障碍，使一种或几种珠蛋白数量不足或完全缺乏，不能形成正常的血红蛋白，红细胞极易被破坏而造成红细胞寿命缩短的溶血性贫血。

地中海贫血基因型和表现型均多样化，根据缺失发生的基因不同，分为ａ与ｐ地中海贫血【１５】。

地中海贫血是我国南方最常见的人类遗传病之一，以往的调查表明，该病在广西南宁等一些地区的发生率居南方高发区之首，ａ和Ｄ地贫的发生率分别高达１４．９５％和１．５２％〔１６】。

ｐ地中海贫血是指合成ｐ链部分或完全抑制的血红蛋白病。

患儿出生时无症状，多于婴儿期发病，生后３”－６个月内发病者占５０％，偶有新生儿期发病者。

主要分型如下①重型：出生数日即可发病，出现贫血、肝脾肿大进行性加重，黄疸，并有发育不良，其特殊表现有：头大、眼距增宽、马鞍鼻、前额突出、两颊突出，其典型的表现是
臀状头，长骨可有骨折。

少数病人在肋骨及脊椎之间发生胸腔肿块，亦可见胆石症、下肢溃疡，如能存活到性发育期则可见月经来潮延迟，第二性征发育不良，常因反复感染而死亡。

另外常见并发症还有急性心包炎、继发性脾功能亢进（可致血小板及白细胞减少）、继发性血色病（可致心、肝、胰及内分泌腺的损害而见心律紊乱、传导阻滞、心衰、糖尿病、性功能发育不良等），见于纯合子ｐ地中海贫血。

②中间型：轻度至中度贫血，患者大多可存活至成年，其肝脾肿大、面部改变与骨骼改变均较重型轻。

③轻型：轻度贫血或无任何症状，发育正常，无面部骨骼改变，一般在调查家族史时发现。

发病年龄愈早，病情愈重。

严重的慢性进行性贫血，需依靠输血维持生命，３～４周输血１次，随年龄增长日益明显，给社会和家庭在经济上和精神上带来沉重的负担。

因此，产前筛查、遗传咨询、产前诊断对降低前言该病的发生率意义相当重大。

在Ｄ地中海贫血中，ＨｂＡ２的水平增高，外周血红细胞ＨｂＡ２含量可高出正常人一倍，ＨｂＦ含量轻度升高（＜５％）或明显增高（２０％”－９９．６％），即ＨｂＡ２和ＨｂＦ的含量改变预示着１３地贫的疾病状态，因此，对ＨｂＡ２和ＨｂＦ的定量检测可作为１３地中海贫血的筛查手段。

目前实验室主要有筛查法和基因检测两大类。

筛查法主要是血液学检查和血红蛋白的分析，主要有（１）红细胞形态：红细胞大小不均，出现嗜碱性点彩红细胞、靶形红细胞、异形红细胞等；（２）红细胞指数：一般来说ＭＣＶ＜８０ｆｌ、ＭＣＨ＜２６ｐｇ作为地中海贫血的可疑指标，ＨＣＴ、ＭＣＨＣ等也会有一定的改变；（３）红细胞渗透脆性、血红蛋白理化性质测定：在低渗溶液中，当水渗透其内部达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂，地中海贫血患者的渗透脆性降低；（４）血红蛋白电泳：是根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的ｐＨ缓冲液中，缓冲液的ｐＨ大于Ｈｂ的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动。

反之，Ｈｂ带正电荷向阴极泳动。

通过电泳可分离出不同血红蛋白的区带，经扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。

这些类型的筛查方法存在特异性差，或灵敏度不够的缺点。

基因检测主要是运用ＰＣＲ技术，该技术在实际运用中发挥了重要的作用，为遗传病的诊断提供了更加可靠的依据，但该技术价格也相对昂贵，不适合广大地贫高发区的大规模筛查。

ＨｂＦ作为一种胚胎期表达的蛋白，在除地中海贫血之外的许多血液系统疾病中都表现为升高，包括：镰刀型细胞贫血、遗传性ＨｂＦ持续增多症、骨髓异常增生疾病以及再生障碍性贫血与夜间阵发性血红蛋白尿等〔１７．２１〕。

ＨｂＦ的水平检测可以作为这些疾病的辅助诊断和疾病预后判断指标。

一般而言，ＨｂＦ升高在血液系统非恶性疾病中被认为是预后良好的迹象，而在产科和某些恶性肿瘤疾病中却被视为疾病进展加重的标志之一。

其次，据国外一些文献报道发现，ＨｂＦ作为一种胚胎期表达的蛋白，可能与恶性肿瘤疾病有关〔２２．２３〕。

免疫组化结果显示，在一些结肠直肠的肿瘤、生殖细胞肿瘤、胚胎性肿瘤，其血管和肿瘤细２硕士学位论文胞间均表现为ＨｂＦ阳性〔２４．２９〕。

因此，我们用流式细胞术、ＰＣＲ、免疫组化的方法探讨肿瘤细胞表达胎儿血红蛋白的情况。

本科室在前期工作中制备了针对Ｈｂ６、丫、…链的单克隆抗体，用ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等方法对单抗的特异性进行了鉴定，并且已经成功研制了检测０【地贫免疫学试剂盒，在上述工作的基础上，我们继续研究用于检测ｐ地贫患者的免疫学检测体系，分别为ＨｂＡ２、ＨｂＦ检测体系，这两个体系可分别用于Ｄ地贫患者诊断和辅助诊断，以及Ｄ地贫的病情监测与预后判断。

而免疫学
检测，是基于抗原抗体反应为基础的，其具有特异性好、快速简便、价格低廉等优点，因而适用于大规模筛查，二者联合应用可极大地提高基层医院的筛查效率。

目前，国外近年也报道了ＨｂＡ２的双夹心ＥＬＩＳＡ体系，但因敏感度不够，尚需在双单抗夹，Ｉ二，ＪＩＲＦＩＴＣ标记的检测抗体后再加ＨＲＰ标记兔抗ＦＩＴＣ，显然尚难以用于临床标本鉴定；国外的ＨｂＦ试剂盒多采用多克隆抗体，特异性欠佳。

国内则尚无ＨｂＡ２与ＨｂＦ的免疫学检测体系。

因此，本课题研究检测ＨｂＡ２和ＨｂＦ的ＥＬＩＳＡ体系，以期能为Ｄ地贫的筛查提供简便的筛查工具。

第一章ＨｂＡ２免疫学检测体系的建立和优化第一章ＨｂＡ２免疫学检测体系的建立和优化在前期工作中，我们制备了４株血红蛋白的单抗，２Ｈ４和ＩＨＩＩ可特异性识别ＨｂＡ２，２Ｃ９、１Ｅ１０贝ｓＪ与ＨｂＡ和ＨｂＡ２均可结合，利用以上抗体筛选得到合适夹心配对，并进行体系优化，成功建立了ＨｂＡ２的夹心ＥＬＩＳＡ免疫学检测体系，经过测试，本检测体系的特异性、测量范围、敏感度等技术指标均适合用于ＨｂＡ２的检测，能够满足基础和临床研究的需要。

１．１材料与方法１．１．１主要材料（１）４株单抗由本实验室在前期工作中按常规方法制备小鼠腹水获得，ＨＲＰ购Ｓｉｇｍａ公司。

（２）血液来源正常人血为本实验室工作人员正常全血，Ｄ地贫患者血取自广.。