菌种保存大家谈。甘油的浓度。

菌种保存大家谈。

甘油的浓度。

2009-08-15 01:13
大家好！
我是保藏中心，最近发现基因酷保藏中心的共享菌株的保存出现了较严重的问题，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心却不能应助，对此我们很抱歉！
因此，在此向大家赐教，菌株应如何保存呢？
望大家能分享经验，多提出建议（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株为佳），一起努力搭建好这个平台，让它能帮到更多酷友！
作者: 保藏中心时间: 09-2-19 10:55
有人说，冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一。

因为没有做过，所以请教做过这方面的酷友，大肠杆菌的冷冻保藏应该注意的事项?
甘油冷冻保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？
作者: 我是好人时间: 09-2-19 21:34
冷冻干燥法是国内外一致认为比较理想的菌种保藏方法。

冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。

它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。

并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。

除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。

保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。

该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。

不适合酷友频繁的求助菌种。

我们实验室保藏菌种，不管是细菌，放线菌还是霉菌和酵母，我们都是用的甘油管保藏。

就是划斜面得到单菌落，将单菌落置于液体培养基培养至对数期，在EP管中保存，菌液与甘油体积比为1：1，甘油要灭菌的。

-20摄氏度保存即可。

我们的菌种有保存七八年的依然能用。

方便快捷。

管理员不妨试试。

作者: 保藏中心时间: 09-2-20 23:03
:'终于有酷友理我了！感动ing
十分感谢您的指教！为了表达谢意，加两点威望
作者: 保藏中心时间: 09-2-20 23:33
如您所说，冷冻干燥法该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备，不适合酷友频繁的求助菌种。

但考虑到一个菌株的传代问题，菌种传代次数对菌株特性的影响？我有这样的想法：每个菌种用冷冻干燥法保藏一些，也用甘油菌保藏（用于给酷友应助，一两年后再拿冷冻干燥法保藏的菌种活化，保新一批甘油菌、穿刺菌用于应助（其实保藏中心一直都有保甘油菌，但06、07年的菌株还是有出现问题）。

这样考虑怎样呢？
看了您介绍的冷冻真空干燥保藏法的操作，有不明白的地方：1、保护剂如脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖要如何处理灭菌呢？2、菌种在冷冻干燥机里冷冻干燥时会不会染菌，还是需要事先处理下冷冻干燥机？3、如何在真空条件下融封？因为没有做过这方面的工作，很多不懂的，问了不少，请谅解。

还有，液氮冷冻保藏法和冷冻干燥法相比哪种方法较好，那种比较适合保藏中心？还是有其它方法更适合呢？
大家多多提出宝贵意见、分享下经验啦！
作者: 我是好人时间: 09-2-22 20:29
5#保藏中心
作者: 我是好人时间: 09-2-22 20:43
液氮超低温保藏法是目前比较理想的一种菌种保藏方法，已被国外一些菌种保藏机构作为常规的方法应用，美国的ATCC已于1965年开始用用，我国的菌种保藏中心也正积极的创造条件，准备或已采用此法。

但投资费用较大，并要有个可靠的氮源。

作者: 保藏中心时间: 09-2-24 09:50
您好！您上传的资料中介绍了好多种菌种保藏的方法，很受用，十分感谢您的帮助和支持！
但我有一些疑问想请教下：
1/您上传的PPT中讲到“在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。

在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。

如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。

”，按这样说快速降温对细胞的损伤较小，但这与细胞放入液氮罐前应先进行梯度降温的做法似乎有矛盾。

2/甘油菌甘油终浓度为40%，这个浓度是如何定的呢？因为甘油具有脱水作用，浓度高了会使菌株脱水死亡，有的人建议用终浓度为10%~20%的浓度，您是如何看待这个情况呢？
作者: 我是好人时间: 09-2-27 10:27
管理员您好，很佩服您发现问题的能力，嘿嘿，我这些资料都是在网上给您找的，
我们实验室也没有这种设备，我也没做过，所以很多问题也不是很清楚。

我们保存菌种都是用的甘油保存，但也没有注意到您说的甘油具有脱水这个问题，很是受用，以后我会注意的。

我们用甘油保存过细菌，酵母，霉菌和放线菌，40%-50%的甘油是它的最终浓度。

甘油浓度过低低温保存易结冰，使菌死亡。

我同学有直接将菌液-20保存的，不加任何保护剂，但保存的时间很短，他们保存过一年的，但很多有死掉的。

我们做大肠杆菌感受态，最终甘油是15%的浓度，有时结冰也会使菌死掉。

我用40%-50%的甘油最终浓度一直很好，也不结冰，所以也没考虑您提出的那个问题，嘿嘿。

对于液氮超低温保藏我又查了本资料，它是把熔封的安瓿管进行慢速冷冻，以每份钟下降1度的速度直至-35度，最后移到液氮中保藏。

其他的就没说什么了。

很不好意思啊。

作者: 保藏中心时间: 09-2-28 17:18
不用不好意思！大家互相交流学习。

我也是上网查了相关的资料，发现有些细节问题说法不一，自己经验少，所以不懂的问题要向大家请教！
作者: wyat1984 时间: 09-3-5 02:40
我们实验室都是用新鲜菌液+50%灭菌甘油1：1混匀，终浓度25%甘油，-80度保存的。

菌体可以多离心收集一点。

冻干保存用的脱脂牛奶110度15分钟灭菌。

其实很多时候大家要的是质粒而不是菌，一般的DH5,JM109之类的大家都有。

为什么不抽成质粒保存呢？-80度基本不会降解。

作者: 保藏中心时间: 09-3-5 10:13
您好！感谢您的支持。

“其实很多时候大家要的是质粒而不是菌，一般的DH5,JM109之类的大家都有。

为什么不抽成质粒保存呢？-80度基本不会降解。

”保藏中心的质粒都是抽提保存的，我想您有些误解了，现出现的是菌株的保藏问题而不是质粒的保藏问题，DH5,JM109之类的菌株是很多人都有，但也还有其它不少的菌株较少的。

作者: nfu03200 时间: 09-3-15 10:45
我这里一般是需要用到质粒的大肠杆菌用15%的甘油1：1和菌液混合，酵母用的是30%的甘油和菌液1：1混合，然后放在-80度冰箱中保存，效果很好
作者: 保藏中心时间: 09-3-16 18:43
我这里一般是需要用到质粒的大肠杆菌用15%的甘油1：1和菌液混合，酵母用的是30%的甘油和菌液1：1混合，然后放在-80度冰箱中保存，效果很好
nfu03200 发表于 09-3-15 10:45
质粒的大肠杆菌用15%的甘油1：1和菌液混合,甘油的终浓度7.5％，感觉挺低的，请问您那里-80度保存大概能保存多长时间？
作者: ferraricyn 时间: 09-3-20 15:17
本帖最后由 ferraricyn 于 09-3-20 15:21 编辑
个人觉得脱脂牛奶冻干的方法保藏效果较好，我们的霉菌就是这么弄
哦，看了一下，原来都是细菌保藏，那还是加甘油保护，液氮速冻，-70保藏吧，呵呵
另外，有的冻干机是有封口功能的，冻干机也是在无菌室内操作的，冻干后可以取出封口，同样是无菌条件下操作的
作者: yueyuetby 时间: 09-3-21 17:37
我们实验室的保存方式是，按3：1的比例加入菌液和甘油，一定要混匀，然后放在-70度冰箱中保存。

作者: rcm001 时间: 09-3-29 21:20
本帖最后由 rcm001 于 09-3-29 21:23 编辑
您好！您上传的资料中介绍了好多种菌种保藏的方法，很受用，十分感谢您的帮助和支持！
但我有一些疑问想请教下：
1/您上传的PPT中讲到“在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。

在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而 ...
保藏中心发表于 09-2-24 09:50
不是啊！细菌保存最好要快速冷冻，我在PASTEUR作博士后时他们的PROTOCOL 都是用液氮先浇在有菌液＋冷冻液的EP管上，冻好后放－80度冰箱，可以保存10年左右。

冷冻液配方需再找找再给你，印象中不是简单的甘油溶液。

动物细胞当然是要缓慢冷冻了。

作者: rcm001 时间: 09-3-29 21:43
本帖最后由 rcm001 于 09-3-29 21:52 编辑
如您所说，冷冻干燥法该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备，不适合酷友频繁的求助菌种。

但考虑到一个菌株的传代问题，菌种传代次数对菌株特性的影响？我有这样的想法：每个菌种用冷冻干燥法保藏一些 ...
保藏中心发表于 09-2-20 23:33
冻干保护剂是先配成溶液，再用0.22um的滤膜过滤除菌，再按比例加到培养到
对数生长期的菌液；真正的冻干机操作当然不会染菌了，进去的空气都是经过滤的；真空封融菌种管是把冻好的菌种管口套在抽气机上，抽至一定真空度，如
6pa，在喷灯上封融。

冻干曲线（温度和真空度随时间调整的曲线）也影响到存活率。

作者: 保藏中心时间: 09-3-30 10:35
不是啊！细菌保存最好要快速冷冻，我在PASTEUR作博士后时他们的PROTOCOL 都是用液氮先浇在有菌液＋冷冻液的EP管上，冻好后放－80度冰箱，可以保存10年左右。

冷冻液配方需再找找再给你，印象中不是简单的甘油溶液。

...
rcm001 发表于 09-3-29 21:20
非常感谢！期待......
作者: rcm001 时间: 09-3-30 21:59
冷冻液配方来了：--翻了半天，终于找到了，是HOGNESS，哈哈－－excellent for E.coli preservation
10X Hogness Modified Freezing Medium:
Solution A: 5 mM MgSO4x4 H2O, 20 mM Sodium Citrate,
85 mM (NH4)2SO4, 45 % Glycerin.
Solution B: 0,66 M KH2PO4, 1,3 M K2HPO4
Dilute "B" 4X with "A" = 10 x HMFM (e.g., 1B + 4A)
例子：
10 x HMFM (Hogness Modified Freezing Medium)
(For freezing of bacteria)
Solution A
MgSO4.7 H2O 0.9 g
Na3-citrate.2H2O 4.5 g
(NH4)2 SO4 9 g
Glycerol (100%) 440 g
The volume was adjusted to 800 ml with sterile water and sterilized by autoclaving.
Solution B
KH2PO4 18 g
K2HPO4 47 g
The volume was adjusted to 200 ml with sterile water and sterilized by autoclaving.
Before using, 640 ml solution A was added to 160 ml solution B.
作者: 保藏中心时间: 09-3-31 10:32
冷冻液配方来了：--翻了半天，终于找到了，是HOGNESS，哈哈－－excellent for E.coli preservation
10X Hogness Modified Freezing Medium:
Solution A: 5 mM MgSO4x4 H2O, 20 mM Sodium Citrate,
85 mM (N ...
rcm001 发表于 09-3-30 21:59
对于您的分享，代表需要它的人感谢您！
需要的酷友大家来试试啦！
保藏中心会尝试看是否适合我们
为表示感谢，给您加上两点威望。

作者: 保藏中心时间: 09-3-31 10:47
冷冻液配方来了：--翻了半天，终于找到了，是HOGNESS，哈哈－－excellent for E.coli preservation
10X Hogness Modified Freezing Medium:
Solution A: 5 mM MgSO4x4 H2O, 20 mM Sodium Citrate,
85 mM (N ...
rcm001 发表于 09-3-30 21:59
Glycerol 是保护剂，Na3-citrate应该是起到一个缓冲体系的作用吧？KH2PO4、K2HPO4 这两个是不是也是属于缓冲体系的？其它的成分就猜不出了～～
可是在这些成分里没有看到有营养成分，看过一些资料，他们的是有加血清、牛奶、培养基之类任一个成分的，没营养成分的话，可以保存十年左右么？
您能不能给我们稍微介绍下这个配方的基本原理呢？
作者: rcm001 时间: 09-4-3 13:01
－－－可是在这些成分里没有看到有营养成分，看过一些资料，他们的是有加血清、牛奶、培养基之类任一个成分的，没营养成分的话，可以保存十年左右么？1）－－－－GOOD QUESTION, 你能指望大肠杆菌在－80C条件下利用营养物质吗？那些蛋白之类的是保护剂。

－－－我用过他们保存10年的菌。

2）所附文件应该可以解释为什么，还有酵母保存的使用方法。

作者: 保藏中心时间: 09-4-6 23:04
－－－可是在这些成分里没有看到有营养成分，看过一些资料，他们的是有加血清、牛奶、培养基之类任一个成分的，没营养成分的话，可以保存十年左右么？
1）－－－－GOOD QUESTION, 你能指望大肠杆菌在－80C条件下利 ...
rcm001 发表于 09-4-3 13:01
感谢您的指教！
作者: rcm001 时间: 09-4-7 15:37
－－不用谢，应该做的。

顺便提一下，取用菌种时也应该特别小心，那些鬼子在我取菌种时都在边上盯着，不是怕我拿了菌种，是提醒我不要把菌种管化了再取，而是用灭菌牙签挑取一点冰冻物，放到试管中即可，菌种管应飞速放回，尽量保持其温度不变，觉得与其长时间保存有关，特再告知。

作者: 保藏中心时间: 09-4-7 16:45
25#rcm001
作者: wwchhappy 时间: 09-4-12 21:53
液体培养基培养后，加入20％的甘油，然后利用液氮速冻后，放置于超低温冰箱（－70度），可以长期保存。

作者: ouclhf 时间: 09-4-13 10:32
菌株加了甘油放在负八十的冰箱里面，一般3-5年都不会死的
为什么会死呢，主要原因是温度不够低，如果是负二十或者负四十那么可能半年就会死掉的。

死了的菌接种液体LB培养基一般是活不了了，建议直接取100微升保种的菌液，涂在不加任何抗性的LB平板上，然后37度培养2天左右，这样一般会长出3-10个单菌落。

这说明其实不是全死了，就是说99.9999%的细胞都死了，用液体的方式无法活化，但是固体平板还是可以活化出来的，个人意见，仅供参考。

作者: 保藏中心时间: 09-4-13 15:39
28#ouclhf
作者: pph0259 时间: 09-4-13 21:03
最简单的办法，培养好的菌，离心去除培养基；然后用新鲜的培养基重悬，加入
20-30%灭菌的甘油，直接-70度冻存！
每一份菌建议保存若干份，每次只拿一份出来活化，给网友。

发现一个反复冻融几次不行了，就再换一份。

这样保存的细菌，至少可以存活1-3年。

就是说每过1-3年，再次全部活化保藏一次，就肯定没问题。

哈哈，这个方法节省。

作者: bugbox 时间: 09-4-15 19:30
我们实验室用20%蔗糖加胎牛血清1:1体积混合，用来保存幽门螺杆菌，-80度保存，效果不错。

初来乍到，班门弄斧仅供大家参考。

作者: nano 时间: 09-4-17 20:03
说一下，甘油管保藏我们实验室从来没有菌株无法活化，-70°状态下，一般使用8-15%的甘油，含有质粒的菌应该以10%左右为宜，高浓度的甘油容易使菌体排斥质粒，但原因不明，且高浓度甘油对菌体是种毒害。

一般在10%浓度甘油保存的菌株3年内没有什么问题，我曾活化过6年前实验室保存的菌株，而且其间由于停电，曾3次温度失控到高于-20°
玻璃化液氮保存自然是好，但是保存和活化的步骤比较复杂，详细可以查阅CRYO 开头的两个杂志
作者: 保藏中心时间: 09-4-19 10:35。