实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察目的要求

二、基本原理
微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段， 个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作 为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或 细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、 平板计数法、光电比浊法等。
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类 鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下， 借助于特殊的测量工具即测微尺，包括目镜测微尺和镜台 测微尺。
实验三 细菌的芽孢染色
一、实验目的
了解芽孢染色的原理，学习并 掌握芽孢染色的制片技术
观察细菌芽孢的形态
二、实验原理
芽孢染色法的基本原理，用着色力强的染色 剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使 染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的 染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水 洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保 留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂 的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
➢培养基配制后还必须进行灭菌。灭菌和消毒是二个不同含义的名词。 消毒是指消灭病原菌或有害微生物，而灭菌则是杀死或消灭一定环境 中的所有微生物。
干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。
五、实验报告
1、结果记录：
将计数结果记录下表。A表示五个中方格中的总菌数。B稀释倍 数为102。
注:1 mL菌液总数=A/5×25×104×B=5×107×A
五、实验报告
1、思考题：
（1）在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？
（2）根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差 主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准 确？ （3）某单位要求知道一种干酵母粉的活菌存活率， 请设计1-2种可行的检测方法。
三、实验材料
1. 酵母菌液 2. 显微镜、血球计数器 3. 盖玻片、毛细管等
Thoma血球计数板
A.正面图 B.纵切面图 1.血球计数板 2.盖玻片 3.计数室
16小格 × 25大格计数室
25小格 × 16大格计数室
计数室的两种刻度形式
四、实验内容
一.酵母菌数量的检测（显微镜直接计数法）
注意事项: A. 取样时先要摇匀菌液;加样时计数室不可有气泡产生。 B. 调节显微镜光线的强弱适当。
依次再进行中倍、高倍观察
5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光
镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏
油中，细调至看清物象为止。
6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。
7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去
镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残
留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体
实验六、七
培养基的制备和灭菌
一、目的要求
学习和掌握各种培养基的制备方法，其中包 括培养基的配制，包扎及灭菌技术。
熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及 操作方法。
二、基本原理
➢培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法 配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子以及 水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能 表现它们最大生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pH 值范围。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成 可分合成培养基和天然培养基。按其物理状态可分固体培养基，液体 培养基和半固体培养基。按其特殊用途可分加富培养基，选择培养基、 鉴别培养基。
均匀，不宜过厚；热固定温度不宜过高，（以玻片背面不烫手为宜）， 否则会改变甚至破坏细胞形态；水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水从 载玻片的一端流下，水流不宜过急，过大，以免涂片薄层脱落。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节， 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。 美蓝染色注意染液不宜过多或过少，否则在盖上盖玻片的时,菌液会溢 出或出现大量气泡而影响观察；同样，盖玻片的不宜平着放下，以免产 生气泡影响观察。 霉菌直接制片注意挑菌和制片时要小心，尽可能保持霉菌的自然生长 状态，加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。
四、实验内容
1. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。
2. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液 自行渗入，计数室内不得有气泡。
3. 静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。
4. 在高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值，然后求得每 个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数， 最后再换算到每mL菌液中的含菌数。
实验一 显微镜油镜的使 用和细菌形态的观察
目的要求 显微镜油镜使用的原理 实验材料 实验程序 思考题
目的要求
学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维 护的基本知识
使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构 造
显微镜油镜使用的原理Ⅰ
显微镜的构造
1.光学部分:接目镜 、
接物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等). 它 使检视物放大,造成物象.
全部复原。
实验程序Ⅱ（显微镜的使用）
显微镜保养和使用中的注意事项： 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证 光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用 油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可 使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯， 以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘 图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不 可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而 腐蚀镜片。
实验报告
1．绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球 菌的染色结果。
实验报告
2．思考题：
你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其 中最关键的环节是什么？
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请 你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌为对 照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。
D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
显微镜油镜使用的原理Ⅲ
油镜使用的原理
1. 香柏油的折射率与玻璃 接近，提高了视野的照明 度。
2 . 提高了显微镜的分辨率
实验材料
五、实验报告
2.思考题：
在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测 定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？
为什么更换不同放大倍率目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重 新对目镜测微尺进行校正？
实验五
微生物数量的测定
一、目的要求
1．明确血细胞计数板计数的原理 2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的 方法。
实验程序III
细菌基本形态和特殊构造的的观察：
1. 利用油镜，结合细菌三型等染色片观察细菌的基本形 态（球状、杆状和螺旋状），边观察边绘图。 2. 观察细菌的特殊构造：
变形杆菌、绿脓杆菌----示鞭毛 破伤风梭菌、枯草杆菌----示芽孢 园褐固氮菌---示荚膜
基本形态的观察
金黄色葡萄球菌 大肠杆菌
两重合线间目镜测微尺格数
2．酵母菌大小的测定：
利用制好的血球器浸片，用高倍镜测出宽和长各占目镜测微 尺的格数，再将测到的格数乘以目镜测微尺（用高倍镜时标定的） 每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。
五、实验报告
（1）将目镜测微尺校正结果填入下表:
接目镜放大倍数：-10×-
五、实验报告
(2)将酵母菌大小测定结果填入下表：
2.机械部分:镜座、镜臂、
镜筒、物镜转换器、载物台、 载物台转移器、粗调节器、 细调节器等部件.它起着支 持 调节 固定等作用.
显微镜油镜使用的原理Ⅱ
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为：
三、实验材料
1. 酵母菌液 2. 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺 3. 载玻片、盖玻片、接种环、胶头吸管等
四、实验内容
注意事项：观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台测微尺的刻 度;换高倍镜和油镜校正时,务必十分小心,防止接物镜压坏镜台测 微尺和损坏镜头。
1.测微尺的校正（标定）：
两重合线间镜台测微尺格数Ⅹ10 目镜测微尺每格长度(μm)=
结束
实验二 细菌的革兰氏染色
目的要求 革兰氏染色原理 实验材料 实验程序 思考题
目的要求
1.初步掌握细菌涂片方法 2.学习并掌握革兰氏染色法步骤
革兰氏染色的基本原理
革兰氏染色是丹麦医生 C.Gram（革兰）于 1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。
根据细菌细胞壁的组分和结构不同，通过革 兰氏染色法可将所有的细菌区分为两大类G+和 G-
二、基本原理
微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段， 个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作 为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或 细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、 平板计数法、光电比浊法等。
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种 特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接 计数的一种简便、快速、直观的方法。
实验材料
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)斜面培养物 大肠杆菌(E.coli)培养物
革兰氏染色的过程– 制片
A. 加小滴水
B. 涂成薄层
涂片制备过程
C. 固定菌体
革兰氏染色的过程– 染色
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
注意事项
革兰氏染色注意载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要
显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸 等。
细菌三型、金黄色葡萄球菌、链球菌、变形 杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、破伤风梭菌、 炭疽杆菌、园褐固氮菌、霍乱弧菌等固定装 片
实验程序Ⅰ（显微镜的使用）
主要是油镜的使用
1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
2.调节光亮度
3.低倍镜观察：粗调、细调
4.
注意事项
使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干， 必要时可添加少许染液。
实验报告
1．绘图表示你观察到的芽孢杆菌的芽孢在形状、 大小、着生位置上有什么不同？ 2．为什么在孔雀绿染色液加热染色中，要待玻 片冷却后才能用水冲洗？ 3．染色是否成功，请总结失败的经验！
实验四
细菌大小的测定
一、目的要求
学习测微尺的使用和计算方法 利用测微尺测量微生物的大小
三、实验器材
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 芽孢染液 载玻片 显微镜 恒温水浴锅等
四、操作步骤
将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌， 作涂片、干燥、固定。 滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 用木夹夹住载玻片在火焰上加热，倾去染液，加热时 间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不 加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6％）染10分钟。 待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。 用番红水溶液复染1分钟，水洗。 待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
四、实验内容
5. 计算方法：
酵母菌细胞数/mL=
（X1+X2+X3+X4+X5）X 5
25（或16）X
10
X
1000
x
稀释倍数
6. 注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和右侧线上 的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时，若芽体和母体同 等大，就按单个酵母计数。
7. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸
你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，
用老龄细菌染色出现什么问题？ 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之
前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响 最终结果？在什么情况下可以采用？
链球菌 霍乱弧菌
特殊构造的观察Ⅰ
鞭毛 变形杆菌
特殊构造的观察Ⅱ
荚 膜
圆褐固氮菌
特殊构造的观察Ⅲ
芽孢
破伤风梭菌
枯草芽孢杆菌
思考题
油镜与普通物镜在使用方法上有不同？ 应特别注意些什么？
使用油镜时，为什么必须用镜头油？
镜检标本时，为什么先用低倍镜观察， 而不是直接用高倍镜或油镜观察？
实验一