二维电泳

-
Dithiothreitol (DTT)
- reducing agent
- breaks disulphide bonds between subunits
-S-S-
DTT
-S-H
+
HS-
2.IPG胶条的平衡
3.第二向SDS-PAGE
(Ettan DALTsix系统) •装板,配胶
•胶条放臵
1367.1-16
三、蛋白质组研究的相关技术
（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：
2-D电泳 1. 1975年，Patrick OˊFarrel发明了二维凝胶电泳。 2. 操作（1）等电聚焦。（2）平衡胶条。（3）第二相SDS-PAGE。 （4）2-D胶上蛋白质鉴定 A 早期Western blot鉴定 B Edman降解法鉴定 C 肽质量指纹鉴定 D 蛋白质组信息学
根据蛋白质等电点的不同而将它们分开的电泳方法称为等电聚焦电泳。 电泳后测定其各种蛋白质 “ 聚焦 ” 部位的 pH ，即可得知它们的等
电点。
2. pH 梯度选择
(1) 传统的凝胶等电聚焦电泳
在等电聚焦电泳中，造成环境由酸至碱逐步变化所用的物质是载体 两性电解质。 特点: 它具有依次递变但相差不大的等电点（ PI ），在电场中可以形成逐渐递
detergent binds strongly to proteins approx. 1 SDS/2 a.a.
Sodium dodecyl sulfate
SDS
+
=
-
-
-
Байду номын сангаас
Protein
Proteins (subunits) become linear. Gives all proteins an equal mass : charge ratio
变而又连续的 pH 梯度。此类物质在等电点处具有足够的缓冲能力，以 保证不致受蛋白质样品等两性物质对 pH 梯度的影响；
在等电点处还具有足够高的电导，保证电流通过，而且整个体系的电导均 匀，使样品迁移不受影响，达到聚焦； 这类物质还具有不与分离物质反应或使之变性，自身化学性质不同于被分 离物质，分子量也小，当电泳后经透析等可与被分离物质分开。
二、样品制备
溶解所有的蛋白质，包括疏水性蛋白 避免溶解性低的蛋白在等电聚焦时由于溶解度降低而沉 淀析出 防止蛋白质的化学修饰
排除核酸，多糖，脂类和其他干扰分子
细胞破碎方法
（1）组织细胞的破碎
组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要 求，使用的破碎方法和条件也不同。 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理 破碎。 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细 胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用 纤维素酶处理也能达到目的。 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一 借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常 有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽 聚糖）。
B
AD/library fusion protein cannot bind to the promoter alone and thus cannot activate transcription:
C
Interaction between the bait and library proteins in vivo activates transcription of the reporter gene:
蛋白质组具有多样性和可变性的特点
（1）蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中是各不相同的。 （2）同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也是在不断改 变的。 （3）在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其变化与正常生理 过程的也不同。
二、蛋白质组学的研究内容
1. 细胞或组织内蛋白质的表达模式及修饰（表达蛋白质组学） ：关 键技术：2-D电泳
5. 追踪胞内信号分子的移位，阐明目标蛋白质在信号转导途径中的位 臵。
五、蛋白质组学研究中的困难
1. 2-D电泳胶上的点只是细胞蛋白质中的一小部分，大部分不 能被显示。 2. 2-D胶上显示的蛋白质有偏向性。 3. 难溶于水或分子量大于18万的蛋白质难于在2-D胶上显示。
4. 质谱技术虽有较高的灵敏度，但对来自2-D胶上的许多低丰度 的蛋白质仍不能鉴定。
(2) 固相pH梯度凝胶等电聚焦电泳
固相干胶条的种类
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
四、第二向SDS-PAGE
1.SDS-PAGE原理 2.IPG胶条的平衡
3.第二向SDS-PAGE
蛋白质组学和双向电泳技术
1－1 蛋白质组学研究概述 1－2 双向电泳技术
1－1 蛋白质组学研究概述
一、蛋白质组学产生背景 二、蛋白质组学的研究内容
三、蛋白质组学研究的相关技术
四、蛋白质组学研究的应用
五、蛋白质组学研究中的困难
一、产生背景
1. 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。随着人类基因组全序列测 定，生命科学跨入了后基因组时代。 2. 因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。 3. 蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢 等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象更难于只靠DNA序列来解释。 4. 蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。 20世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。
2D 電泳 → Mass 定序分析
（二）研究蛋白质胞内分布及移位的方法
1. 研究蛋白质组的高通量方法。分别收集细胞不同区域内蛋白质， 然后进行2-D电泳和蛋白质鉴定。 2. 将胞内特定蛋白质进行荧光标记，然后在荧光显微镜下进行观察 蛋白质移位。
（三）构象解析技术
1. 实际测定具体蛋白质的三维结构：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分 析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。
•Marker制作 •电泳条件的选择
pH 3
Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size. Smallest proteins travel the furthest distance
charge
pH 7.5
1－2 双向电泳技术
一、概述 二、样品制备 三、第一向等电聚焦 四、第二向SDS-PAGE 五、染色 六、图象分析 七、蛋白点的后续分析
一、概述
双向凝胶电泳是利用不同蛋白质的物理、化学性 质的差异，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平 面上展开。
第一向等电聚焦: 等电点
第二向SDS-PAGE：分子量
pH 7.5
pH 3
+
pH10
– pH10 –
size
五、染色
•考染法
•银染法
•荧光染料法 •放射自显影
Bacillus subtilis
（四）研究蛋白质功能模式的技术
酵母双杂交系统 选择性噬菌体感染技术
质谱技术
四、蛋白质组学研究的应用
1. 用于寻找疾病相关的蛋白质：标志物。
2. 用于微生物蛋白组研究，彻底阐明病原微生物的致病机理并寻找全 新的药物作用靶点。
3. 蛋白质组数据库将成为药物设计的路标。
4. 对不同生物的蛋白质组进行比较性研究，可以对生物进化途径提供 参考，对多细胞生物的起源提供线索。
X-射线单晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。 运用原子力显微镜及多功能光学诊断技术深入研究蛋白质晶体生长的机理。 2. 通过氨基酸序列知识去辨识和推引出其决定的三维结构 （1）用分子力学、分子动力学的方法，根据理化的基本原理，从理论上计 算蛋白质分子的空间结构。 （2）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的 关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。
载体两性电解质的局限性：
载体两性电解质是混合的复合物，很难定性，而且存在生产批次差异的 问题，降低了第—向分离的重复性。 载体两性电解质pH梯度不稳定且易漂移，在电泳过程中往往向负极漂 移。影响电泳的重复性。 柔软的聚丙烯酰胺管胶的机械强度低，胶棒有可能被拉长或断裂，从而 影响电泳的重复性。电泳结果好坏往往依赖操作者的熟练程度。
三、第一向等电聚焦
1.等电聚焦原理
2.pH 梯度选择
1. 等电聚焦原理
蛋白质（酶）、多肽等两性分子，其所带电荷的数量与性质，随所处 环境的 pH 而变化。环境 pH 低于其等电点时，带正电荷，在电场中 向阴极移动；环境 pH 高于其等电点时，带负电荷，在电场中向阳极 移动；环境 pH 等于其等电点时，不带电荷，在电场中不移动。据此， 在电泳系统中创造一个由阳极向阴极， pH 由低到高的连续而稳定 pH 梯度环境，那么处在这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将 根据所处环境的 pH 与其自身等电点的差异，分别带上正电荷或负电 荷，并向与它们各自的等电点相当的 pH 环境位臵处移动，当到达该 位臵时即停止移动，从而各自焦聚（聚焦），分别形成一条集中的蛋 白质区带。
Proteome & Proteomics 定义?
Proteome (蛋白质组) :
1994年提出，最早见于文献是1995年7月的 “Electrophoresis”杂志上。由1个细胞，或1种器官或组织的 基因组所表达的全部相应的蛋白质。 Proteomics（蛋白质组学）:
研究在某个时间或某种特定条件下细胞或组织的蛋白表达及 其活动规律的科学。
2.蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学）：确定蛋白质 在亚细胞结构中的位臵，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合 物组成等。 3.蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）：X-射线单晶衍射 分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三 维重构术（电子晶体学）。 4. 蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与 其他分子的相互作用。
3.结构蛋白组学
1. 2. 3. 4. 5.
靶序列的选择； 克隆表达 纯化 结晶或同位素标记 x－ray或NMR解析 结构
4.功能蛋白质组学
酵母双杂交
A
The DNA-BD/protein X (bait) binds promoter but cannot activate transcription:
1.SDS-PAGE原理
SDS 十二烷基硫酸钠：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和 三级结构，使蛋白质变性 强还原剂：使半胱氨酸之间的二硫键断裂，由于SDS与蛋白质的结合是 按质量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子 大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈 线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率 ，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数 作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它 的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
（2）细胞器的分离
细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还 有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防 止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将 细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适 当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸 、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同 速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心 后，即可获得所需组分。
Proteomics
1.Expression proteomics (表达蛋白组学)
The study of global changes in protein expression
2.Cell-map proteomics （细胞图谱蛋白组学）
The systematic study of proteinprotein interactions through the isolation of protein complexes