!!好氧反硝化菌的分离鉴定及特性研究

好氧反硝化菌的分离鉴定及特性研究
张光亚,陈培钦
(华侨大学生物工程与技术系,福建泉州　362021)
摘　要　从土壤中分离到1株能以硝酸钠为氮源进行好氧反硝化作用的细菌,命名为Rhodococcus sp.DN,分离菌株革兰氏染色为阳性,球状或杆状,菌落颜色为橙红色。

该细菌能以乙酰胺为惟一碳源和氮源,能进行氨化和硝化作用并产生亚硝酸。

部分长度的16S rDNA序列分析表明,所分离的细菌与Rhodococcus ruber的16S rDNA序列具有99%相似性。

关键词　好氧反硝化;Rhodococcus sp.DN;16S rDNA序列;系统发育分析
中图分类号　S154.38+1 文献标识码　A 文章编号　1005-7021(2005)06-0023-04
Isolation,Identif ication and Characteristics of Aerobic Denitrifying B acteria
ZHAN G Guang2ya,CHEN Pei2qin
(Dept.of Biotechnol.&Bioengi n.Huaqiao U niv.Quanz hou,Fujian Prov.362021)
Abstract　An aerobic denitrifying bacterial strain name as DN was isolated from soil.The cells growth cycle was hy2 pha2rod2cocci.The clones of the strain were orange2red.Strain SDN could denitrify nitrate companying with the for2 mation of nitrite in aerobic environment.It could use acetamide as the sole carbon and nitro gen sources.The phylo2 genetic analysis based on partial16S rDNA suggested that the strain DN was the closest relative to Rhodococcus ruber with99%of sequence similarity.The phylogenetic analysis of strain DN was performed by PHY L IPS and unrooted phylogenetic tree of strain DN and the neighboring denitrifying bacteria given.
K eyw ords　aerobic denitrification;Rhodococcus sp.DN;16S rDNA sequence;phylogenetic analysis
一般认为硝化作用只发生在好氧条件下,而反硝化只能在厌氧或缺氧的条件下进行。

但20世纪80年代科学家发现了好氧反硝化菌,而在许多实际运行中的好氧硝化池中也常常发现有30%的总氮损失[1,2]。

这使得对好氧反硝化的研究日趋活跃。

这些好氧反硝化菌中有很大一部分也具有异养硝化的能力。

如A lcaligenes f aecalis、Thiosphaera pantot ropha(现更名为Paracoccus denit rif icans)[3]能同时利用氧和硝酸作为电子受体以获得高生长率。

人们推测这些好氧反硝化菌可能广泛存在于废水生物处理池和自然环境中,而且对废水生物脱氮有一定的贡献。

利用好氧反硝化细菌发展好氧脱氮技术具有以下几个优点:第一、使硝化/反硝化反应在同一个反应器中进行,可以大大减少占地面积和建设资金;第二、使用好氧反硝化细菌可以减少处理过程中加入调节系统p H的化学物质,降低成本;第三、在处理过程中好氧反硝化细菌更容易控制[4]。

使得好氧脱氮技术受到极大的关注。

本文从土壤中经富集、分离和纯化,获得一株好氧反硝化细菌并进行了鉴定,现将结果报道如下。

1　材料与方法
1.1　异养型硝化细菌的分离
1.1.1　培养基组成　乙酰胺2g,NaOH1.6g, KH2PO48.2g,MgSO4・7H2O0.5g,KCl0.5g, CuSO4・5H2O0.5mg,CaSO4・2H2O0.5mg, ZnSO4・7H2O0.5mg,FeCl3・6H2O0.5mg,H2O 1L,p H7.0。

1.1.2　富集分离　取土样于上述培养基中,经富
　收稿日期:2004-09-20
　作者简介:张光亚　男,讲师,博士。

研究方向为酶与生物信息学。

　基金项目:华侨大学科研基金资助项目(03HZR7)32
微生物学杂志　2005年11月第25卷第6期　JOURNAL OF MICROBIOLOGY Nov.2005Vol.25No.6
集,在平板上划线分离,分别挑取单菌落于液体培养基中,检测液体中亚硝酸含量,选取产亚硝酸较强的一株分离物进一步试验。

1.2　碳源和氮源试验
培养基氮源改为硫酸铵(质量浓度0.2%),碳源分别为0.2%(质量浓度)的乙酸钠、甲酸钠、苹果酸、葡萄糖、衣康酸、乙酰胺、酵母膏和蛋白胨。

氮源试验时,碳源改为乙酸钠,所用氮源分别为浓度0.2%的乙酰胺、硫酸铵、硝酸钠、亚硝酸钠、尿素和氨基乙酸。

培养60h后,测定菌体数量和亚硝酸量。

3次重复。

1.3　分离菌株反硝化活性
以硝酸钠(质量浓度为0.2%)为惟一的氮源,以乙酸钠为碳源,培养基煮沸5min后取20mL放入120mL的血清瓶中,菌株活化后接种于该液体培养基中,每隔一定时间测定菌体生长量和亚硝酸量。

3次重复。

1.4　好氧反硝化细菌的鉴定
1.4.1　显微摄影　用带拍摄装置的Olympus BH22型光学显微镜拍摄,菌落中的菌体用接种针挑取后涂抹在载玻片上,滴加1/4滴蒸馏水,加盖盖玻片,用相差拍摄。

1.4.2　16S rDNA的PCR扩增和测序　从平板中直接挑取一环菌体,加入至100μL重蒸水中,旋涡混匀后,沸水浴7min,12000r/min离心5min,上清液直接用于PCR扩增模板。

用于16S rDNA PCR反应的引物为一对通用引物:正向引物BSF8/20:5′2A G A GTTTG A TCCTGGCTCA G2 3′;反向引物BSR1541/20:5′2AA GG A GGT2 G A TCCA GCCGCA23′。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应体系(50μL)见文献[5]。

PCR产物用Q IA G ene公司的DNA纯化试剂盒纯化。

测序由上海申友生物技术有限责任公司完成,测序用引物为引物BSF8/20。

1.4.3　系统发育分析　获得分离菌株部分长度的16S rDNA序列(约602bp),菌株的EMBL序列登录号见表1。

将所测序列通过Blast程序与G enBank中核酸数据进行序列联配(http:// /blast)[6],并利用序列比对软件ClustalX1.8[7],同时用ClustalX1.8自带的NJ PLO T程序构建了系统发育树。

用于系统发育树构建的相关菌株见表1。

表1　用于系统发育树构建的分离菌株和相关参比菌株的细菌名称、菌株编号和序列登录号Table1　Names,strain number and accession number of sequences of strains and the related bacteria used in
the construction of the phylogenetic tree
细菌名称菌株编号序列登录号
A lcaligenes denit rif icans DSM12141T AJ005447 Paracoccus denit rif icans ATCC19367Y16930 Paracoccus versut us ATCC25364Y16932
A lcaligenes f aecalis B3/I U71008
A rthrobacter globif ormis DSM20124T X80736
A rthrobacter ramosus DSM20546T.X80742
Bacill us coagulans IAM12463T.D16267
Bacill us denit rif icans DSM466Z26927
Nit rosovibrio tenuis A Y123803
Nit rosospi ra sp.NpAV Y10127
Nit rosomonas europaea M103AF037106 Pseudomonas aerugi nosa ATCC25330.M34133 Pseudomonas puti da ATCC11172.D85992 Rhodococcus coprophil us ATCC29080T.X81928 Rhodococcus sp.DN AJ459106 Rhodococcus ruber DSM43338T.X80625
Nit rosomonas ureae AF272414
2　结果与讨论
2.1　分离菌株16S rD NA序列测定及鉴定
经富集和分离,获得1株能进行异养型硝化反应的细菌,命名为菌株DN。

分离菌株菌落为橙红色,呈球状或杆状,革兰氏阳性。

分离的菌株经破碎后提取基因组DNA,以一对通用的真细菌16S rRNA的引物(正向引物和反向引物)作PCR扩增,得到的产物经纯化后测序,测序后,得到长度为602bp菌株的16S rDNA 的序列(菌株EMBL的序列登录号为AJ459106)。

序列联配的结果表明,分离菌株与Rhodococcus ruber16S rDNA的相似率达99%,结合菌株的形态学和生理学特性,可基本确定分离的菌株为Rhodococcus sp.。

命名为Rhodococcus sp.菌株DN(其形态见图1)。

Rhodococcus sp.与现已报道的好氧反硝化菌均不相同。

2.2　菌株D N的反硝化作用
以硝酸钠(浓度为0.2%)为惟一的氮源,乙酸钠(浓度为0.2%)为碳源,培养基煮沸5min 后取20mL放入120mL的血清瓶中,灭菌,菌
42 微　生　物　学　杂　志 25卷
株活化后接种于该液体培养基中,菌株在以硝酸为氮源的培养基上生长时,菌体生长曲线及溶液中亚硝酸浓度的变化曲线如图2示。

由图2可知,菌体的反硝化主要是在菌体的对数生长期发
生的,而在菌体进入衰亡期后,溶液中的亚硝酸的
浓度一直处于很低的浓度水平。

乙酸钠在好氧反
硝化过程中起着非常重要的作用,它不但作为细
菌Rhodococcus sp.生长所需的碳源,也是菌株进
行反硝化过程中能量的来源,在C/N比为5时,
反硝化速率达到最大[4]。

本实验中C/N约为2/
1,可能尚未达到该菌株最佳C/N比,需要进一步
研究,以确定此时它的最大反硝化速率。

图1　菌株DN的相差照片(1200×)
Fig.1　Phase2contrast photomicrographs of strain DN
图2　菌株反硝化作用
Fig.2　Denitrification of strain DN
2.3　不同碳源对分离菌株生长和产亚硝酸的影
响
分离菌株DN可在以硫酸铵(0.2%)为氮源,
碳源分别为浓度0.2%的乙酸钠、甲酸钠、苹果
酸、葡萄糖、衣康酸、乙酰胺、琥珀酸、酵母膏和蛋
白胨的培养基中生长,但在不同碳源底物中的生
长情况不一(图3)。

在酵母膏中其生长量最大,
琥珀酸中生长量最少,对甲酸钠和衣康酸则不能
利用。

说明该菌株具有相对较广的碳源谱。

图3　不同碳源对菌株生长的影响图
Fig.3　Effect of carbon sources on
the growth of strain DN
2.4　不同氮源对菌株D N生长和产亚硝酸的影
响
菌株DN在乙酸钠(浓度为0.2%)为碳源,
氮源分别为浓度0.2%的乙酰胺、硫酸铵、硝酸
钠、亚硝酸钠、尿素和氨基乙酸的培养基中的生长
情况有一定的差别(图4)。

在乙酰胺中的菌体生
长最好,而在硝酸钾中生长量最少,对亚硝酸则不
能利用,可能是溶液中亚硝酸的浓度相对较高,对
菌株有一定的毒害作用。

图4　不同氮源对菌株生长的影响
Fig.4　Effect of nitrogen sources on
the growth of strain DN
52 6期 张光亚等:好氧反硝化菌的分离鉴定及特性研究
2.5　Rhodococcus sp.D N 的系统发育分析 将获得的菌株与某些好氧反硝化细菌以及一
些自养型和异养型硝化细菌进行系统发育分析,用N 2J 法构建系统发育树,得到的系统进化发育树的结构如图5。

可以发现这些细菌分为两群,
Rhodococcus sp.菌株DN 则接近于Rhodococcus ruber ,二者在系统发育地位上几乎相同,这与
Blast 获得的信息一致,从而进一步证实所分离菌
株的分类学地位。

图5　基于16S rDNA 序列同源性用N 2J 法构建的无根系统发育树
Fig.5　Unrooted phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of strain DN and related species
3　小　结
3.1　本文分离的菌株DN 经鉴定为Rhodococcus sp.,它与目前所报道的好氧反硝化菌均不相同
,
表明了自然界中好氧反硝化菌的生物多样性,对
揭示好氧反硝化菌群的生态学有重要的意义。

3.2　菌株DN 能分别以适当浓度的乙酸钠、苹果酸、葡萄糖、乙酰胺、琥珀酸、酵母膏和蛋白胨为碳源,以乙酰胺、硫酸铵、硝酸钠、尿素和氨基乙酸为氮源,具有较广的碳源和氮源谱。

使得该菌株适应力较强,可能存在于活性污泥中,有应用于污水好氧反硝化脱氮处理的潜力。

参考文献:
[1]　冯叶成,王建龙,钱易.同时硝化反硝化的实验研究[J ].上
海环境科学,2002,21(9):527-529.
[2]　丁爱中,傅家谟,盛国英.好氧生物反硝化反应的实验证据
[J ].科学通报,2000,45(增刊):2279-2282.
[3]　Lukow T.,Diekmann H.Aerobic denitrification by a newly
isolated heterotrophic bacterium strain TL1[J ].Biotechnology Letters ,1997,11(19):1157-1159.
[4]　Huang H K.Tseng S K.Nitrate reduction by Citrobacter di 2
versus under aerobic environment [J ].Appl Microbiol Biotech 2nol ,2001,55:90-94.
[5]　张光亚,陈美慈,韩如　,等.一株异养硝化菌的分离鉴定
及系统发育分析[J ].微生物学报,2003,43(2):156-161.
[6]　Altschul S F ,Madden TL ,Schaffer AA ,et al .G apped BLAST
and PSI 2BLAST :a new generation of protein database search programs [J ].Nucleic Acids Research ,1997,25:3389-3402.
[7]　Felsensein G ,Churchill G A.A hidden Markov model approach
to variation among sites in rate of evolution[J ].Molecular Biol 2ogy and Evolution ,1996,13:93-104.
62 微　生　物　学　杂　志 25卷。