利用飞行质谱技术从卵巢癌患者血清中筛选特异生物标志物

第二军医大学硕士学位论文利用毽行质谱整查丛塑墨蟹璺耋坐堕！塑垫壁墨塑竺塑堑查塑ｌＳＥＬＤＩ—ＴｏＦ蛋白质芯片仪的组成及工作原理
美国ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ生物公司生产的ｓＥ∽Ｉ—ＴＯＦＭｓ（ｓｕｒｆａｃｅｅｎｈａｎｃｅｄｌａｓｅｒ（】ｅｓｏｒｐｒｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ—ｔｉｍｅｏｆｆ１ｉｇｈｔｍａｓｓ）主要包括三个基本部分。

１．１蛋自芯片阵列（ｐｒｏｔｅｉｎｃｈ．ｐａｒｍｙ）
蛋白芯片阵列是特殊材料制成的固相载体，呈１０ｍｍ宽、８（）ｌＩｌｍ长的条索状外形，其中包含着８个～１６个直径为２咖的圆形孔斑，亦被称为芯池（图１）。

组成芯池的特殊材料是根据要捕获蛋白质的属性而设计地，概括起来可归纳为两大类型：①化学型材料；②生物化学型材料。

生物化学型材料表露被习惯陆地设置成开放性准活化平台，可以粘附预设计的诱饵分子；生物化学型平台根据特定的分子识别机制（如抗原一抗体、酶一酶作用物、受体～配体及蛋白质～ＤＮＡ等相互作用），亦可选择性地从样品中捕获目的蛋白。

化学型平台则是利用蛋白质的疏水性、亲水性、电荷特性及金属离子等普通属性设计而成，可分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属离子螯和芯片及混合芯片６种，用于检测未知蛋白，并获取指纹图谱。

它可以使粗提液或样品中同一属性的蛋白质结合到芯池表面（图２）。

蛋白质芯片的制备：将ｌ¨ｌ左右生物样品（血清、血液、精液、尿液、细胞裂解液等）点到芯池中，经过一段时间，蛋白质通过亲合作用结合到芯片的化学或生物位点上。

用缓冲液梯度（调整ｐＨ或盐浓度）冲洗未结合或非特异结合蛋白质数次．在用弱缓冲液洗去残余盐离子及去污剂。

室温静置干燥后，加入能量吸收分子（ｅｎｅｒｇｙａｂｓｏｒｂｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＥＡＭ）溶液，目的蛋白便与能量吸收分子形成晶体。

以促进蛋白质在ｌｓ行时间质谱检测中的解吸附和离子化。

图ｌ蛋白芯片
第二军医大学硕士学位论文利用飞行质谱技术从卵皋堡垒考堡煎生箜垄壁墨塑兰塑堡查塑
化学表蔼
图２芯片表面类型
１．２蛋白质芯片解读仪（ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｐ心ａｄｅｒ）
蛋白质芯片解读仪是安装有脉冲式紫外线／氮激光光源的解析离子化（１ａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＬＤＩ）时间一飞行质谱仪（ＴｏＦ嬲）。

计算机以每秒１×１０９Ｈｚ的速度从所获得的原始数据快速精确的绘制出蛋白质质谱图。

其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。

结合了Ｅ撇后的蛋白质在激光的激发下电离，带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需的时间不同，蛋白质的质荷比（Ｍ／ｚ）与离子飞行时间的平方成正比。

由Ｅ＝ｕｚ＝１／２ｍｖ２；ｆ＝兰推出Ｍ，ｚ＝Ｋｔ２＝尝ｆ２。

其中ｚ为离子
ｖ上．
所带电荷数，ｕ为电压，ｙ为飞行速度，Ｌ为加速飞行电场电压，Ｋ为常数（图３）。

带有正电荷的蛋白质离子束在到达检测器的一瞬间，电子倍增器将产生瞬时电流（瞬时电流Ｉｔ＝Ｑ／ｔ，其中Ｑ为ｔ时刻检测器检测到的电荷数）转换成蛋白质的相对含量。

这一复杂过程的完成则是通过联结到电脑上的高速模拟一数字转换器实现的。

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图３ＳＥＬＤＩ～ＴＯＦ船工作原理示意图
１．３蛋白质芯片软件控制分析系统（Ｓｏｆ细ａ柙）
ｓＥＬＤＩ蛋白质芯片仪首要的作用在于识别、分离出两个或多个不同样品蛋白质表达库中的不同蛋白质。

利用传统的方法对样品中的蛋白质进行识别、分析是相当复杂的过程，尤其对临床工作中收集的样品条件要求非常高。

传统蛋白质的研究多采用色谱分离纯化，二维电泳，光谱，质谱定量定性等分析化学的研究技术。

运用这些手段进行研究所登须的技术条件要求高，仪器昂贵，步骤繁琐，耗时冗长，不适应于大规模筛选和临床检验。

ｓＥＬＤＩ－ＴＯＦ—姻技术是在基质辅助激光解析及离予化（№ｔｒｉｘ～ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，姒ＬＤＩ）的基础Ｊ：发展而来的，可赢接从原始样品中进行捕获、检测与分析，敏感性高（检测范围为ｌ～５０ｆｍ０１ｅ蛋白质），检测范围广（Ｏ．５～５００ｋＤａ），所需样品体积小（ｏ．５～４００ｕ１）；检测简便，同时有可靠的重复性。

蛋白质芯片软件控制分析系统，使整个操作过程变的自动化、简捷化、人性化。

利用ｓｏｆｔ霄ａｒｅ通过电脑显示屏上出现的对话框就可以对实验进行控制操作，并对所得的数据进行分析、统计。

软件控制分析系统不断地处于研发过程，目前所用的软件系统为ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｐ
第二军医大学硕士学位论文利用飞行质谱技术从卵巢癌患者血清中筛选特异的生物标志物（２）置于摇床上，室温孵育９０ｍｉｎ后除去样品。

３．７芯片冲洗
冲洗
１、从上述１５０ｐｌ蛋白变性后的血清样品中取５０Ｈｌ样品，加２００ｕｌ（１：５稀释样品），相就的结合／洗脱缓冲液，使最后上样的样品总共稀释约４０倍，取５０ｕ１上样。

（仔细观察，并确保每个点上无气泡）。

２、置于振荡器上，４℃孵育６０ｍｉｎ后除去样品。

芯片冲洗
】、每孔中加入１５０ｕ１相应的结合／洗脱缓冲液；
２、置于振荡器中室温孵育５ｍｉｎ，除去缓冲液：
３、重复卜２步骤２次（总共３次）；
４、各种芯片用相应ｐＨ的ｌｍＭＨＥＰＥＳ淋洗３０秒：如再ｃｘ用ｐＨ４，ＩＭＡｃ、Ｈ４用ｐＨ７（按ｓｃｉｅｎｃｅ文章修改而来）总共洗两次；
５、去除水，可以通过将操作平台反扣到吸水纸上的方法除去多余的水分；
６、将芯片移出操作平台；
７、可用干净的实验专用纸吸水；
８、除去水分后晾干芯片。

第二军医大学硕士学位论文利用飞行质谱技术从卵巢癌垦耋血清蜷垫特异堕皇塑！至查塑个（图６），其中病人组与正常人组在３６处蛋白质含量存在统计学显著性（Ｐ＜Ｏ０５）。

４．３卵巢癌相关性蛋白
图６蛋白质波峰检测结果图
使用ｃｉｐｌｌ明筘ｎ公司Ｂｉｏｓｙｓｔｃｍｓ软件的Ｂｉｏｍ硼【盯Ⅵ，ｉｚａｒｄ功能，分别对卵巢癌组与正常对照组血清样品的蛋白质波谱进行比较，发现共有６个波峰的强度值在卵巢癌和健康人之两者间存在明显差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），分别位于４４７２Ｄａ，７７７ｌＤａ，８１３ｌＤａ，８１４９Ｄａ，８３４４Ｄ钆８９３６Ｄａ。

通过数据挖掘软件ＢｉｏＭ缸ｋｅｒＰａ曲ｅｍ分析，发现Ｍ／ｚ值为４４７２Ｄａ的蛋白质在正常人组波峰强度明显较卵巢癌组高。

（图７）
相对含量
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质荷比Ｍ『Ｚ
图７病人与正常人在质荷比为“７２Ｄａ处的蛋白质含量的差别卵巢癌卵巢癌正常人
正常人
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图ｌＯｓＥＬＤＩ．１．ｏＦ．Ｍｓ联合生物信息学方法在卵巢癌诊断中的模式图
结论
１、卵巢癌患者与正常人血清蛋白质组学水平差异显著。

２、Ｍ／Ｚ值为４４７２Ｄａ的蛋白质在正常人血清中波峰强较卵巢癌患者度明显升高，可能是卵巢癌的新的标志物。

３、ｓＥＬ脚．ＴｏＦ技术是寻找疾病相关性蛋白质的有效工具。

４、利用蛋白质组学技术结合生物信息学分析将有利于建立薪的疾病诊断模式一一指纹图谱。

展望及后续工作
本研究建立了血清蛋白质指纹图谱的实验方法，该实验方法稳定可靠，具有很好的重复性，成功地用于多种肿瘤的蛋白质指纹图谱诊断模型的建立。

对卵巢癌组与正常对照组血清样品中的蛋白质波谱进行眈较，发现共有６个波峰的强度值在卵巢癌和健康人之两者间存在明显统计学差异（Ｐ，ｏ，０１），其Ｍ／ｚ值分别是４４７２Ｄａ，７７７１Ｄａ，８１３１Ｄａ，８１４９Ｄａ，８３“Ｄａ，８９３６Ｄａ。

用４４７２Ｄａ的血清蛋白质作为生物标志物可将正常人与卵巢癌患者准确的分组。

准确率为９８．７５嘲７９／８０、，。