纳豆菌的分离筛选与鉴定

2018,V 〇I.35N 〇.08
Chemistry & Bioengineering
doi :10.3969". issn .1672 — 5+25.2018.08.008
钱泽栋，张佑红，卢育兵，等.纳豆菌的分离筛选与鉴定化学与生物工程，2018，35(8) $1-44.
QIAN Z D ,Z H A N G Y H ,L U Y B ,et al. Isolation, screening, and identification of Bacillus n a t t o '(. Chemistry R Bioengineering ，2018,35(8) :41-44.
纳豆菌的分离筛选与鉴定
钱泽栋，张佑红"，卢育兵，朱丽娜，田莉
(武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉43007+)
摘
要
：采用酿蛋白平板相筛，从日本北海道生产的纳豆食品中筛选出5株产纳豆激酶的菌株，分别编号XD 1$5 %
再采用纤维蛋白平板复筛，通过比较透明圈大小筛选得到高产纳豆激酶菌株XD 2,并通过16S rD N A 基因序列对其进行 鉴定.结果表明，5株菌株均能产纳豆激酶并能分解纤维蛋白，其中，菌株XD 2所产纳豆激酶的酶活最高，为989. 3 U •
mL 1 %6S rD N A 基因序列鉴定菌株XD 2为枯草芽胞杆菌&
关键词：纳豆；纳豆激酶；筛选；鉴定中图分类号：T Q 924 Q 939. 97
文献标识码：A
文章编号！672-5425(2018)08-0041-04
Isolation?Screening?and Identification of Bacillus natto
QIAN Z e dong,ZHANG You -hong " ,LU Yu -bing,ZHU Li -na,TIAN Li
(.School o f Environmental Ecology and Biological Engineering，Wuhan Institute o f
Technology , Wuhan 430074 , China )
Abstract ： We screened five nattokinase-producing strains from the natto food (produced from Hokkaido Ja ­pan ) by casein plate preliminary screening , and named them as XD 1 — 5. T h en , we obtained a high nattokinase - producing strain XD 2 by fibrin plate secondary screening in accordance with the size of the transparent circle , and identified strain XD 2 by 16S rDNA gene sequence . The results show that five strains all produce nattokinase and decompose fibrin , in which strain XD 2 is the best , which is identified as Bacillus subtilis with the highest enzyme activity of 989. 3 U • mL —1.
K ey words ： natto ； nattokinase ； screen ； identification 纳豆是日本的传统食品，距今已有2000多年历 史，纳豆是日本普通家庭日常生活必不可少的食物之 一，并且被大力推广[1]。

纳豆含有丰富的营养成分，如 各种氨基酸、蛋白质等，具有溶栓作用，还有药用价 值[]。

血栓性疾病严重威肋人类的生命，世界每年死 于血栓性疾病的人数高达1 500万以上[]。

各国积极 研发相关溶栓类药物，纳豆激酶具有安全性好、成本 低、作用迅速、纤溶活性强等众多优点[4 ]，受到广泛关 注。

1987年，S u m i 等5首次在纳豆中提取出纳豆激 酶，发现纳豆激酶能够溶解血栓纤维蛋白。

2002年，
M ilner 等6发现，纳豆激酶是200多种具有纤溶作用 物质中最具潜力的纤溶蛋白酶。

赵仲麟等[7]从我国黑 豆中筛选出一株纳豆激酶生产菌株，酶活为509. 64 I U .mL —\薄金岭[]从酱豆和日本纳豆中筛选出一 株纳豆激酶生产菌株，酶活达242 IU • mL -\奚晓 琦等9从纳豆食品中分离纯化得到3株具有较高纳豆 激酶活性的菌株，采用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定酶 活高达 1 804. 64 IU • m L —1。

作者以日本北海道生产的纳豆食品为原料，从中 筛选出一株纳豆激酶高产菌株，并通过16S r D N A 基
收稿日期！018-04-08
作者简介：钱泽栋（1993 — ),男，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向：微生物和发酵工程，E -m a il$54978795@qq . com ;通讯作者：
张佑红，教授，博士生导师。

因序列对其进行鉴定。

1实验
1.1材料、试剂与仪器
日本北海道生产的纳豆食品。

A ga r、牛肉膏、蛋白胨均为国产生化试剂；纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶，上海源叶生物科技有限公司；其 它试剂均为国产分析纯。

BS124S型分析天平、PB-10 型 pH 计，Sartorius; Y X Q-LS-75S型立式蒸汽压力灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；BS-1E型振荡培养箱，常州国 华电器有限公司；m f s-n型多功能三维旋混仪，深圳 潘西诺生物科技有限公司；T D Z5-W S型台式多管低速离心机，长沙平凡仪表有限公司；A I R T E C H型超净工作台，苏净集团安泰公司。

1.2培养基与缓冲液
酪蛋白平板（])%琼脂2,酪素0.5,葡萄糖#1，酵母膏 # 1，K2H P040. 1，K H2P040. 05，M gS04 0.01，pH 值 7. 0$7. 2。

种子培养基（]$蛋白胨1. 0,牛肉膏0. 5，NaC1 0. 5，pH 值 7. 0$7. 2。

发酵培养基（]$葡萄糖1，蛋白胨2，N a H P04 0. 2，NaH2P040.1, M gS040.05，CaCl2-2H20 0. 02,pH值 7. 0〜7.2。

固体培养基（]$蛋白胨1. 0,牛肉膏0. 5，NaC1 0. 5,琼脂粉 2，pH值 7.0$7. 2。

菌种保藏培养基（]$与固体培养基相同。

以上培养基均需在121_灭菌锅中灭菌20.4。

P B S缓冲液：称取2. 63g P B S固体粉末，用250 .L超纯水溶解即可。

1.3方法
1.3. 1酶活的测定
粗酶液的制备：挑取一环平板上的菌种接种到装有50m L种子培养基的250 m L锥形瓶中，在150r -min-1、？”恒温摇床中培养12h;种子液以2]接种 量接种到装有50m L发酵培养基的250 .L锥形瓶中，在150r -min-1、37°C摇床中培养48h;取发酵液1m L于离心管中，3 000 r -min-1离心15 min，上清 液即 为粗 液。

纤维蛋白平板制作[10]:称取72m g纤维蛋白原溶解于36m L P B S缓冲液中，得到2mg -mL-1纤维蛋白原缓冲液，于+5 C恒温水浴锅中预热。

称取700 m g琼脂糖溶解于70m L P B S缓冲液中，高温加热至全部溶解，于59C水浴锅中保温。

将1 000 U凝血酶粉末溶解于1m L无菌生理盐水中，分装10管，每管 100U -mL-1，置于一20C冰箱保存。

用移液管移取7m L琼脂糖缓冲液于小锥形瓶中，快速用另一支移液管移取+m L2mg -m L-1纤维蛋白原缓冲液加人到小锥形瓶中，最后加人110 )L凝血酶，拿起小锥形瓶轻轻摇勻，倒人直径9 c m的平板中，将平板贴在平的实验台上轻轻摇勻，让平板平面看起来平齐。

待其冷却凝固为乳白色的平板，用1m L去头的胶头滴管打，于+C保 。

尿激酶标准曲线的绘制：将已知酶活的尿激酶用无菌超纯水溶解稀释为800 U-m L-1、600 U-mL-1、400U -mL-1、200 U -mL-1、100U -mL-1的 浓度梯度，各取10 p L加人到纤维蛋白平板的小孔中，置于37C恒温箱中培养18h，取出，测量透明圈直径并计算平均直径，以平均直径的平方表示透明圈的面积。

以透明圈的面积为横坐标、酶活为纵坐标绘制尿激酶标准曲线。

根据标准曲线计算菌株实际酶活。

1. 3. 2菌株的初筛
无菌超净工作台上，用灭菌的勺子挑取+粒纳豆(大约5g$加人到装有10颗小玻璃珠和50m L无菌生理盐水的250 m L锥形瓶中。

将锥形瓶置于振荡培养箱中于37°C、150r -min-1培养6h，取出锥形瓶于80C水浴锅中水浴15min，以杀死多余的营养体和杂菌。

将锥形瓶迅速拿出放人冷水浴中，快速冷却至室温。

用移液枪取上述菌液1m L，按10倍梯度分别稀释到 10-1、10-2、10-3、10—4、10-5、10-6、10-7、10-8。

每个梯度菌液各取100 PL加人到酪蛋白平板中，用涂 抹玻璃棒将其涂布均勻。

将平板倒置于37C恒温培养箱中连续培养48h，待平板上长出大小合适的菌落时，往平板里加人几滴饱和硫酸铵溶液以便于观察透明圈的大小（未分解的酪素与溶液反应生成白色沉淀$挑选出透明圈直径与菌落直径比（圈菌比）较大的 菌落，连续在固体培养基上进行平板划线，直到得到纯化单菌落，涂布菌种保藏培养基。

1. 3. 3菌株的复筛
用无菌接种环挑取一环初筛的单菌落，按照粗酶液的制备方法操作，每组3个平行。

取粗酶液10 PL 加人到纤维蛋白平板的小孔中，于37 C恒温培养18 h，用游标卡尺从3个不同的方向测量透明圈直径，取 平均值，比较透明圈大小，筛选出最佳菌株。

1.3.4菌株的鉴定
对菌株进行形态学观察与16S r D N A鉴定。

(1)细菌总D N A的提取
挑取一环筛选的菌株于种子培养基中，37 C培养---------钱泽栋，等：纳豆菌的分离筛选与鉴定
/2018
钱泽栋，等：纳豆茼的分离筛选与鉴定/2018 %篇M 期
尸
2.0849r616.25
及2=0.9984
300 350 400 450 500 550 600
650 700
透明圈面积/ m m 2
图1
尿激酶标准曲线
Fig. 1
Standard curve o f urokinase
对尿激酶标准曲线进行线性拟合，得线性方程％ =2. 0849:c —616. 25，_R 2 = 0. 998+ 说明尿激酶酶活
与透明圈面积呈线性关系。

2. 2
初师结果
通过酪蛋白不板初筛，最终筛选出5株菌株，编号 为XD 1$5,如表1所示。

从表1可以看出，5株菌株的圈菌比大小依次为:
XD 1>XD 2>XD 5>XD 3>XD 4,其中菌株 XD 1、XD 2 产纳
豆的能力相对较高，可以作为复筛的主要目标菌。

12h ,取+ m L 囷液，用生工（S a ng o n B io te ch )公司提 供的
因组D N A 快速抽提试剂盒进行提取。

(2) P C R 扩增
P C R 扩增引物由生工公司提供，上游引物为
27F : 5)A G A G T T T G A T C C T G G T C A G A A C G A A C G
C T -3’，下游$&；1+92R :5’-T A C G G C T A C C T T G T - T A C G A C T T C A C C C C -3’。

PCR 扩增体系：Taq 酶
0. 25 )L ,10X P C R b u ffe r 5 )L ,te m p la te 1 )L ,d N T P
m ixtu re + )L ,上游引物 27F (10 )m ol /70 )L )3. 5 )L ，
下游引物 1+92R (10 p m o l /80 p L ) )L ，d d H z 〇32.25
y L ，体系总体积50 p L 。

P C R 程序：9+ °C 预变性5 m in ; 9+ °C 变性 30 s ，55 °C 退火 30 s ，72 °C 延伸 1m in ，
30个循环72C 延伸5m in 。

(3) P C R 产物回收
将P C R 产物配上D L 10000 D N A M a r k e r 放人含 有G o ld V ie w 染料的1]琼脂糖凝胶电泳，用 分析
仪检测是否在目的片段区看到清晰条带。

#)16S r D N A 基因序列分析
16S r D N A 的测序结果由生工公司完成，将测序 结果提交N C B I 的B L A S T 进行多序列相似性分
：
X 才，利用M E G A 5. 0绘制系统进化树，确定种属。

2结果与讨论
2.1尿激酶标准曲线（图1)
1!Tab.1 !
初师结果
Results of preliminary screening
菌株
直/
m
明 直/m m
圈菌比
XD 1 4. 8318. 893891X D 2 4. 7918. 64 3. 89X D 3 4. 9818. 173865X D 4 4. 56158743845XD 5
4. 81
17. 98
3874
2.3复筛结果（表2)
2!Tab. 2
Results of secondary screening
菌株XD1XD 2X D 3X D 4XD 5明
直 /m m
27845
27875
26813
24. 38
26854
从表2可以看出，5株菌株的透明圈大小依次为:
X D 2>X D 1>X D 5>X D 3>X D + 菌株 X D 2 所产纳豆
激酶的酶活最高，为989.3 U - m L —1。

2.4形态特征（图2)
图2
菌株X D 2的形态特征
Fig. 2
Morphological characteristics of strain XD2
从图2可以看出，菌株XD 2呈圆形，白色或乳白 色！
较扁V ，边缘不整齐，中间有突起！ 伏，
明。

2.5 16S r D N A 鉴定结果
将菌株XD 2的16S N D N A 基因序列经过NCBI 的B L A S T 比对，发现菌株XD 2与 的同
源性达到99]。

XD 2与B L A S T 数据库中近
缘菌株进行多序列比对，利用软件M E G A 5. 0的N-J
绘制系统发育树，如图3 。

根据16S r D N A 基因序列分析，鉴定菌株XD 2为。

3结论
V
1S • n y
胺饍讎藜
暍
钱泽栋，等：纳豆茼的分离筛选与鉴定/2018 %篇8期
gg | Bacillus subtilis strain LXA7(GQ861467.1)^ Bacillus subtilis strain SJ32(KU361185.1)__r Bacillus sp. QW37(KJ950457.1)
^'B acillu s methylotrophicus strainDB10-1 (KU862323.1)
-------Bacillus tequilensis strain JS20H(KX129847.1)-----Bacillus tequilensis strain 111-4(JX065214.1)
Bacillus sp. LB159(KJ564121.1)
Bacillus subtilis strain IP18(KY621529.1)
—Bacillus methylotrophicus strain LZ043(JQ023605.1)
—5cci7/ussp.CRll(KR780415.1)
02^
13
97图3菌株Y '2的N -J 发育树分析（重复次数1000)
Fig. 3
N-J phylogenetic tree analysis of strain XD2
(1000 bootstarp resampling)
以日本北海道生产的纳豆食品为原料，经过初筛 和复筛，最终筛选出一株酶活最高的菌株，编号为 XD 2,酶活为 989. 3 U - m L —1 * 经过 16S r D N A 基因 序列鉴定！ XD 2为 *
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