Western blotting 方法

B 免疫印迹主要步骤
1）蛋白提取
取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。

95°C水浴5分钟。

10000g 4°C离心30分钟，取上清。

每管20μl 分装。

2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白提取液加入1/5体积的6倍上样缓冲液，目标蛋白SPAR、NR2A、NR2B、NR1、PSD-95和Actin使用7.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

浓缩胶使用80V 恒压约1小时，分离胶使用120V 恒压1-2小时。

整个过程电泳槽使用冰浴自来水降温。

3）转膜和封闭
取6张与凝胶大小相同的滤纸和1张PVDF膜，100%甲醇浸泡PVDF膜15秒活化。

把滤纸和活化后的PVDF膜一起浸泡到转膜缓冲液中。

将电泳后的凝胶放置于等面积的PVDF膜上，然后夹在滤纸中，滤纸上下各三层，挤走夹层中的气泡。

将夹层物放置于电极之中，膜一面朝向正极，接通电源，25mA 恒流电转移过夜。

带有分离蛋白的PVDF膜放入10%脱脂牛奶TBS-T溶液中，37°C封闭1.5小时。

5）一抗二抗孵育
弃去封闭液，PVDF膜装于加有相应的一抗的塑料袋，再用封口机将塑料袋封上，一抗的量为150 μl/cm2，所有抗体均用加入5%BSA和0.02%叠氮钠的TBS-T 稀释，37°C温浴1小时40分钟。

SPAR一抗来自于美国乔治敦大学Pak教授的馈赠，其它抗体均为商业来源，抗体的浓度根据实际情况进行调整，但是同一批实验在预实验条件确定以后，使用相同的抗体浓度。

SPAR抗体（1:400稀释）；NR2B抗体(1:500稀释; Millipore, 美国)；NR2A抗体(1:1,000稀释; Abcam, 英国)；PSD-95抗体(1:4,000稀释; Affinity BioReagents, 美国)；Actin抗体(1:3,000稀释; Santa Cruz Biotechnology, 美国)。

将PVDF膜用TBS-T 15 min洗1次，5 min洗3次。

加入相应的辣根过氧化物酶标记的IgG（用TBS-T 1:4000稀释，Santa Cruz, CA），37°C温浴1小时20分钟。

6）显影
PVDF膜用TBS-T 15 min洗1次，5 min洗3次，加上ECL（Santa Cruz，CA），暗室曝光。

C 试剂配方
1）匀浆缓冲液（pH7.5）：20mM HEPES(pH 7.5), 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.2mM DTT (临用时加入), 0.5mM 矾酸钠，0.4mM PMSF（临用时加入）1％SDS（临用时加入）。

DTT：配成1M母液。

溶于0.01M 乙酸钠（pH5.2），过滤除菌，分装，-20°C 保存。

PMSF：配成10mM (1.74mg/ml)母液，溶于异丙醇，-20°C保存。

2）30% Acr-Bis：30g Acr，0.8g Bis，补足双蒸水至100ml并混匀，过滤后存于棕瓶，于4°C保存。

3）分离胶缓冲液4×（pH8.8）：18.17g Tris碱，4ml 10%SDS储液，用36 % 浓HCl调pH至8.8，定容到100ml。

约需要浓盐酸3ml。

4）浓缩胶缓冲液4×（pH6.8）：6.06g Tris碱，4ml 10%SDS储液，用12M HCl 调pH至6.8，定容到100ml。

约需浓盐酸4ml。

5）10%APS ：称量约0.2g左右的APS，根据重量决定加入双蒸水的量，现配。

6）电泳胶的制备：
分离胶：7.5% 浓缩胶：3%
30% Acr－Bis 5 30% Acr－Bis 1.0
4×分离胶缓冲液 5 4×浓缩胶缓冲液 2.5
10% SDS 0.2 10% SDS 0.1
1% TEMED 2 1% TEMED 1
双蒸水7.7 双蒸水 5.35
10% AP 0.1 10% AP 0.05
7）电极缓冲液5×：15.1g Tris，72.0g Gly，5.0g SDS，补足ddH2O至1000ml并混匀，用前稀释至1×。

8）6×SDS凝胶上样缓冲液：300mM/L Tris-HCl(pH6.8)，600mM/L DTT，12%SDS，0.6%溴酚蓝, 60%甘油。

9）转膜缓冲液：6.055g Tris碱，28.33g Gly，400ml甲醇，共溶于2L去离子水（不用调pH）。

10）TBS 10×（pH7.5）：48.44g Tris碱，160.3g Nacl，76ml 1M的HCl，补足双蒸水至2L,调节pH到7.5，4°C 保存。

配1L约需要36%浓盐酸14 ml。

11）TBS-T：Tween-20加入1×TBS（使Tween达0.1%（v/v））。

12）0.02%的叠氮钠：先用TBS配成20%的母液，用的时候再稀释成0.02%。

13) 5×上样缓冲液：1.0 M Tris（pH6.8）0.6ml，50％甘油5ml，10％SDS 2ml，β-巯基乙醇0.5ml，1％溴酚蓝1ml，加去离子水0.9ml，共10ml。

Sepsis and bacterial load determination. (细菌性败血症和载菌量)For E. coli sepsis models, bacterial peritonitis was induced by an i.p. injection of either 2.5 107 CFU/g E. coli (O55:B5, ATCC 12014). For CLP, mice were anesthetized with pentobarbital (80 mg/kg, i.p.). The cecum was exposed through a small abdominal midline incision and the cecum below the ileocecal valve was ligated. The ligated part of the cecum was punctured through both surfaces twice with a 22-gauge needle. After repositioning the bowel, the abdomen was closed. Mice subjected to sham CLP underwent the same procedure, except for ligation and puncture of the cecum. Mice
were treated with LECT2 (0.5 μg/g i.p.) 30 min after induction of sepsis. Survival was monitored once daily for 8 d.
Mice were infected with bacteria and euthanized with i.p. pentobarbital 18 h postinfection. Blood, liver, and spleens were harvested aseptically. Each liver or spleen was homogenized in 1 ml of sterile PBS. Homogenates and blood were serially diluted in sterile PBS, plated onto separate Luria-Bertani agar plates, and the plates incubated for 18 h at 37°C. Colonies were counted separately for each sample. Liver and spleen samples were normalized to organ weight, and blood samples were normalized to blood volume.。