外周血髓源抑制细胞对晚期肺癌患者化疗效果的影响

外周血髓源抑制细胞对晚期肺癌患者化疗效果的影响
李洁瑶;陈孚
【摘要】目的分析晚期肺癌患者外周血中粒系髓源抑制细胞(G－MDSC)与单核系髓源抑制细胞(M－MDSC)在化疗前后的比例变化,观察二者对化疗效果的影响.方法采用流式细胞术(FCM)检测56例晚期肺癌患者和25名健康人外周血中两群MDSC的比例,检测其中22例连续化疗患者不同化疗周期两群 MDSC水平.结果①患者外周血中G－MDSC(CD14 －CD11b+)较M－MDSC(CD14 +CD11b+)高(P＜0. 05),健康人G－MDSC低于M－MDSC(P＜0. 05).与健康人相比,晚期肺癌患者G－MDSC比例较高(P＜0. 001),但M－MDSC比例无显著差异.②在连续化疗患者中,随着化疗周期的进行,SD组与PR组的G－MDSC比例显著降低,而PD 组无明显变化;在不同疗效组间,M－MDSC比例在化疗期间无明显差异.③化疗结束后,PR组G－MDSC比例低于SD组／PD组(P＜0. 05).④在化疗前,外周血中G－MDSC比例高的患者疗效较差(P＜0. 05).结论在晚期肺癌患者中G－MDSC水平高于M－MDSC,G－MDSC高于健康对照组,其比例高低与化疗效果呈负相关.【期刊名称】《河南医学研究》
【年(卷),期】2018(027)020
【总页数】5页(P3649-3653)
【关键词】晚期肺癌;单核系髓源抑制性细胞;粒系髓源抑制性细胞;化疗
【作者】李洁瑶;陈孚
【作者单位】郑州大学第一附属医院肿瘤科河南郑州 450052;郑州大学第一附属医院肿瘤科河南郑州 450052
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2
髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是具有免疫抑制功能
的一群未成熟的异质性细胞，主要由未成熟髓样细胞(immature myeloid cell，IMC)和髓系前体细胞组成。

在正常生理状态下，骨髓产生的IMC很快分化为成熟的粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞；在病理状态下，IMC分化过程受阻，导致MDSC表达水平升高[1-2]。

MDSC可以分为单核系(CD14+CD11b+)和粒系(CD14-CD11b+)2种类型[3]。

既往研究发现初治肺癌患者外周血中两群MDSC
较正常人增高，并与疾病进程相关[4]，但与化疗疗效的相互关系报道较少。

肺癌是我国癌症发病率和死亡率居首的恶性肿瘤，中位生存期仅为8～11个月，1年生存率约35%[5]。

70%～80%肺癌患者确诊时已达中晚期(ⅢB～Ⅳ期)，失去了手术时机，因此化疗成为晚期患者的主要治疗手段之一。

本实验采集不同疗效肺癌患者各化疗周期前后外周血，分析其MDSC中粒系和单核系的改变，并通过MDSC各亚群的变化与化疗疗效相结合，为肺癌患者找到新的治疗靶点，使化疗、手术、放疗和免疫治疗相结合，提高患者生存率和生活质量。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源对照组健康供者25例，年龄32～75岁(平均55岁)，均由河南省红十字血液中心提供。

肺癌组患者56例，均为2016年1—7月郑州大学第一附
属医院肿瘤科经病理细胞学确诊，据AJCC分期标准(第7版)判定为Ⅲ～Ⅳ期住院患者，入选前未经抗肿瘤治疗，Karnofsky评分>70分，预计生存期>4个月。

肺癌组男33例，女23例；年龄32～83岁，中位年龄62岁；鳞癌19例，腺癌28
例，小细胞肺癌9例；临床分期Ⅲ期21例，Ⅳ期35例；无淋巴结转移22例，
发生淋巴结转移34例；无远处转移22例，发生远处转移34例。

肺癌患者与对
照组在年龄、性别方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2 试剂和仪器 PE-Cy7标记的CD11b单抗，APC-Cy7标记的CD14单抗，FITC标记的CD3单抗，Percp标记的7AAD单抗及同型抗体购自BD Pharmingen公司。

超净工作台购自珠江市再鑫仪器有限公司，离心机购自Thermo Scientific公司，流式细胞仪购自BD Biosciences公司。

1.2 方法
1.2.1 标本采集在无菌条件下采集肿瘤患者空腹外周血6 ml(EDTA抗凝)，已征得患者及家属同意。

其中22例患者连续规律完成4个周期化疗，分别于每周期化疗前及第4个周期最后1 d抽血，连续采集5次。

1.2.2 流式细胞术检测MDSC 对患者与健康供者外周血于采集后6 h内采用Ficoll 密度梯度离心法(2 500×g，25 min)分离获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。

调整细胞密度至1×106/ml，加入免疫荧光抗体或相应同型抗体，混匀后室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测PBMC中相应细胞比例。

首先圈取7AAD和CD3阴性细胞团，然后分析该群细胞中
CD11b+CD14-和CD11b+CD14+细胞的比例。

1.2.3 疗效评价对所有肺癌患者均采用含铂类两药联合化疗方案，2个周期后评价疗效。

疗效评价按照WHO制定的实体瘤客观疗效评定标准分为完全缓解(CR)、
部分缓解(PR)、稳定(SD)和进展(PD)。

1.2.4 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。

组内比较采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验，不同周期比较采用重复测量资料的方差分析(若Mauchly’s Test of Sphericity P<0.05，则以Greenhouse-Geisser法校正)，不同疗效组比较采用单因素方差分析，进一步多重比较采用LSD法，G-MDSC水
平与疗效的关系分析采用χ2检验。

检测水准α=0.05。

2 结果
2.1 肺癌患者与对照组外周血中MDSC水平晚期肺癌患者外周血中G-MDSC比例高于M-MDSC，差异有统计学意义(P=0.023)，见图1a；对照组中结果相反，G-MDSC比例低于M-MDSC(P=0.031)，见图1b。

肺癌患者外周血中G-MDSC 高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，见图1c，M-MDSC组间差异无统计学意义(P=0.432)，见图1d。

2.2 肺癌患者外周血MDSC在化疗期间的变化 22例肺癌患者接受4个周期化疗，治疗结束后复查，评价疗效。

PD组5例，SD组8例，PR组9例，CR组0例。

选取化疗前和第2、4个化疗周期后肺癌患者，采集外周血进行流式细胞术检测。

PD组G-MDSC的水平无规律性变化，SD组和PR组不同周期G-MDSC差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

其中第2、4个周期后G-MDSC较化疗前明显下降(P<0.05)，见图2，第2个周期后与第4个周期后比较，变化不明显。

M-MDSC在PD组呈上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，SD组和PR组变化不显著。

表1 化疗期间肺癌患者外周血中MDSC水平组别疗效化疗前第2个周期后第4个周期后PG- MDSC( CD14-
CD11b+)PD(n=5)57.38±6.0746.90±11.2759.02±10.630.546SD(n=8)63.92±6 .2337.95±7.7538.02±6.730.001PR(n=9)43.51±8.9224.43±4.4320.64±4.410.0 20M-
MDSC( CD14+CD11b+)PD(n=5)23.06±4.9624.22±8.9634.10±14.140.660SD (n=8)22.18±3.9031.06±5.7923.43±5.950.291PR(n=9)44.90±7.9932.94±8.10 44.70±8.880.186
图1 正常对照组与肺癌组外周血中两群MDSC水平比较
采用流式细胞术分析外周血中G-MDSC和M-MDSC比例，圈取CD3-细胞团，
然后分析CD11b+CD14-MDSC和CD11b+CD14+ MDSC的水平。

a为肺癌患
者外周血中G-MDSC与M-MDSC的比例差异；b为健康人外周血中G-MDSC
与M-MDSC的比例差异；c为肺癌患者与健康人外周血中G-MDSC的比例差异；d为肺癌患者与健康人中M-MDSC的比例差异。

LC：肺癌患者，HD：健康人；
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。

图2 不同疗效组不同化疗周期肺癌患者外周血中MDSC比例(%)
PD组、SD组和PR组各1例患者化疗期间外周血中G-MDSC和M-MDSC水平的变化情况。

2.3 肺癌患者不同疗效组G-MDSC水平差异 PD组、SD组化疗前G-MDSC水平高于PR组，差异无统计学意义(P>0.05)。

第2个化疗周期后PD组、SD组和PR 组之间呈递减趋势，差异无统计学意义(P>0.05)。

4个周期化疗后，PD组、SD 组、PR组G-MDSC水平差异有统计学意义(F=7.353，P=0.004)，疗效越好则
G-MDSC水平越低，且PD组高于PR组(P=0.001)，SD组低于PD组，高于PR 组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 不同疗效组肺癌患者G-MDSC水平比较
2.4 G-MDSC的水平与化疗效果的关系 G-MDSC在体内主要发挥免疫抑制功能，并影响免疫治疗疗效[6]，本研究发现G-MDSC因化疗效果不同而改变，针对G-MDSC对化疗疗效的影响进行如下分析。

将初治晚期肺癌患者根据化疗前G-MDSC水平分为高水平组和低水平组；将化疗疗效根据是否好转分为两组，
PD+SD组为未好转组，PR称为好转组。

结果发现，G-MDSC低水平组化疗效果较高水平组好(χ2=4.180，P=0.041<0.05)。

见表2。

表2 不同G-MDSC水平患者化疗疗效情况[n(%)]组别n未好转好转高水平
1310(76.92)3(23.08)低水平93(33.33)6(66.67)
3 讨论
MDSC在肿瘤免疫中具有促进肿瘤细胞的逃逸，加速疾病进展的效应，主要是通
过分泌精氨酸酶1(ARG1)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、ROS等抑制因子发挥免疫负调控作用[7-8]。

MDSC高表达ARG1，分解T细胞活化必须的精氨酸[9]；iNOS诱导产生的NO影响Th1/Th2的平衡[10]，下调IL-2及IFN-γ的作用，增加IL-4及PGE2的产量[11]，上调IL-4R的表达[12]；ROS下调TCR相关ζ链导致T细胞活化信号不能传递，并可触发血管生成相关信号[13]。

最终使机体固有免疫和适应性免疫功能的低下，促进疾病的发展和恶化。

在肺癌患者中，MDSC水平高于正常人，并与患者病情分期相关，终末期癌症患
者外周血中MDSC水平较早期患者高[14-15]。

本实验采用流式细胞术对56例晚期肺癌患者和25例健康对照者外周血中两群MDSC水平进行检测，结果表明肺
癌患者外周血中G-MDSC高于M-MDSC，健康对照者G-MDSC低于M-MDSC，患者G-MDSC高于健康对照组，二者M-MDSC水平无明显差异。

研究表明，肿瘤患者G-MDSC水平达70%～80%，M-MDSC水平为20%～30%[16]。

因此，癌症患者体内的免疫微环境中G-MDSC可能发挥主要抑制功能。

由于70%～80%肺癌患者确诊时已达中晚期(ⅢB～Ⅳ期)，失去了手术时机，化疗成为晚期患者主要治疗手段之一，但目前为止化疗抑制恶性肿瘤增长，缓解瘤负荷的效率仍不高，并附带许多药物副反应，如粒细胞减少、末梢神经炎、脱发、疲乏和关节痛等[17]。

大部分患者依旧受肿瘤及瘤副综合征折磨，寻找敏感靶点，提高肿瘤治疗有效率已成为迫在眉睫的问题。

MDSC作为免疫抑制细胞，在恶性肿瘤
中的作用日益被重视，许多针对其靶向治疗的研究正在展开。

化疗作为晚期恶性肿瘤治疗的首选及常规治疗，明确其与MDSC的相互关系可为指导临床治疗提供依据。

已有研究表明，MDSC可随手术切除肿瘤和放疗进行而减少[18]，在疗效好
的患者组MDSC明显降低。

本研究对22例晚期肺癌患者每个周期化疗前外周血
中两群MDSC进行检测，结果发现所有入组患者根据第1个周期化疗前G-MDSC 水平高低分组，G-MDSC水平高则疗效差，水平低则化疗疗效好。

同时，在SD 组、PR组，随着化疗周期的进行，G-MDSC逐渐降低，PD组G-MDSC则无明
显变化，而M-MDSC在不同疗效组变化均不明显。

对4个周期化疗后不同疗效组G-MDSC水平进行比较发现，PR组明显低于SD组和PD组，可见化疗效果越好，G-MDSC水平越低。

近来研究表明，恶性肿瘤中G-MDSC可能主要发挥抑制作用，但其作用和水平易受到干扰，如贮存、冷冻[19]。

因其主要发挥免疫抑制功能，所以其低水平者预后较高水平者好，且随化疗效果的改善，其下降趋势更显著。

综上所述，在晚期肺癌患者中G-MDSC水平高于M-MDSC，G-MDSC高于健康对照组，其比例高低与化疗效果呈负相关。

在SD组、PR组，G-MDSC可随化疗减少，疗效越好，其终末水平越低。

因此，MDSC作为免疫抑制细胞，可能为影
响化疗效果的因素之一，为晚期肺癌综合治疗提供潜在靶点，并为判断治疗效果提供依据。

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