酵母单杂交系统在植物分子生物学研究中的应用

第30卷　第1期
2008年1月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNA L OF BEI J I NG FORESTRY UNI VERSITY
V ol.30,N o.1Jan.,2008
收稿日期:20062
2112210http :ΠΠw w ,http :ΠΠ 基金项目:国家自然科学基金项目(30570990)、黑龙江省科技厅重点攻关项目(G B05B104)。

第一作者:王琪。

主要研究方向:植物分子生物学与基因工程。

电话:04512255190734　Email :wangqi198169@1631com 地址:150030黑龙江
省哈尔滨市东北农业大学生命中心植物生物工程研究室。

责任作者:朱延明,教授。

主要研究方向:植物分子生物学与基因工程。

电话:04512255190734　E m ail :ym zhu2001@yah 地址:同上。

酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的应用
王　琪　朱延明　王冬冬
(东北农业大学生命科学学院)
摘要:酵母单杂交系统是由酵母双杂交系统衍生来的研究DNA 与蛋白质之间相互作用的新型系统。

该文系统阐述了单杂交系统的基本原理和技术路线,详细综述了其在植物基因工程各个领域的应用研究进展,即克隆抗渗透胁迫类转录因子基因,确定已知DNA 与蛋白质之间的相互作用,定位已证实的具有相互作用的DNA 结合结构域以及验证转录激活作用;并分析了当前该系统在植物基因工程研究中存在的问题,进而结合自己的研究对解决问题的途径进行了探讨。

关键词:酵母单杂交;植物基因工程;转录因子;转录激活结构域;DNA 结合结构域中图分类号:Q94312 文献标识码:A 文章编号:10002
21522(2008)012201412207W ANG Qi ;ZH U Y an 2ming ;W ANG D ong 2dong.Application of yeast one hybrid system in plant gene
engineering .Journal o f Beijing Forestry Univer sity (2008)30(1)14122147[Ch ,42ref.]C ollege of Life Science ,N ortheast Agricultural University ,Harbin ,150030,P.R.China.
The yeast one hybrid system is the new type system deriving from yeast tw o hybrid system to study the interactions between DNA and protein.This paper briefly introduces the principle and technical line of this system ,and particularly summarizes the progress of this system in plant genetic engineering field ,such as cloning the transcription factor genes of osm osis resistance type ,of embry ogenesis type ,and of disease resistance type ;confirming the interaction between known DNA and protein ;making sure the localization of the confirmed DNA binding domain ;m oreover validating the transcriptional activation activity.Furtherm ore ,the authors analyzed the problems existing in this system on the research of plant genetic engineering ,as well as forecasted the development prospect according to the research.
K ey words yeast one hybrid ;plant genetic engineering ;transcription factor ;transcription activation domain ;DNA binding domain
近年来,植物学的研究已经从基因组时代转向到后基因组时代。

植物基因组测序工程使得人们获得了大量的基因序列信息,但是这些基因的功能多数还是未知的。

因此,现今更为重要的任务是将其研究重点转移到功能基因组和蛋白质组的研究上。

酵母单杂交系统是一种能识别稳定结合于DNA 上蛋白质的强有力方法,其突出特点是可在酵母细胞内研究真核细胞的DNA 与蛋白质间相互作用,并通过筛选cDNA 文库直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列。

自20世纪90年代问世以来[1]
,已经被众多的研究者们广泛应用于各个领域的科学研究中。

该系统在医学和药学等领域的应用
研究较早,我国学者在2001年即得到了抗乙肝表
面抗原抗体(H BsAb )高度同源的蛋白[2]
以及与人ε
22珠蛋白基因表达相关的基因
[3]。

然而,酵母单杂交
系统在植物基因工程中的研究起步较晚,目前的研究主要集中在转录因子基因的克隆等方面。

本文首先对酵母单杂交系统的原理和技术体系进行了系统总结,并全面地阐述了国内外利用该系统在植物基因工程研究领域取得的进展及展望,对于今后利用酵母单杂交技术进行植物功能基因组研究具有重要的指导意义和参考价值。

1　酵母单杂交系统
111　酵母单杂交系统的原理
酵母单杂交系统是Li 等
[1,4]
根据酵母双杂交技
术的原理提出的,用于研究DNA 2
2蛋白质之间的相互作用,其原理如图1所示。

图1　酵母单杂交系统原理图
FIG URE 1　M ap showing the principle of yeast one hybrid system
真核生物基因的转录起始需要转录因子的参
与,转录因子通常由一个DNA 结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成,即DNA 结合结构域(Binding D omain ,BD )和转录激活结构域(Activation D omain ,AD )。

用于酵母单杂交系统的酵母G A L4蛋白是一种典型的转录因子,G A L4的DNA 结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(Upstream Activation Sequence ,UAS ),而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或转录因子TFII D 相互作用,
提高RNA 聚合酶的活性。

DNA 2
2BD 和AD 对激活转录是必不可少的。

理论上,任何一个AD 都可以与
任何一个DNA 2
2BD 结合并激活转录,即杂合的DNA 22BD 和AD 可以组成一个具有功能的转录激活蛋白。

不仅如此,只要DNA 2
2BD 和AD 能够通过一定的方式在空间上足够的靠近(例如借助其他蛋白质的相互结合使其足够靠近),即使它们之间没有共价结合也可以激活转录。

因此,在酵母中表达的两个相互作用的蛋白质分别与转录因子的DNA 结合结构域
和转录激活结构域相融合,形成两个杂交体,即BD 22X 和AD 22Y (图1A 、B )。

单独的BD 22X 或AD 22Y 都不能启动下游报告基因的转录(图1A 、B ),但BD 2
2X 与AD 2
2Y 的相互作用可以重新形成有功能的转录因子,从而激活含有BD 结合位点的启动子下游报告基因的表达(图1C )。

据此,我们可将G A L4的DNA 结合结构域置换为文库蛋白编码基因,只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用,同样可通过转录激
活结构域激活RNA 聚合酶,启动下游报告基因(通
常使用LacZ )的转录[5]。

112　酵母单杂交系统的技术路线
以筛选cDNA 文库获得新的蛋白质基因为例,简要介绍一下酵母单杂交系统的技术流程。

首先制备一个符合需要的cDNA 文库,并将其构建到AD 质粒载体的特定区域;同时将顺式作用元件四联体或靶基因构建到BD 质粒载体中的基本启动子下游;将AD 和BD 质粒共转化到酵母的感受态细胞中,经筛选得到阳性克隆,然后将获得的阳性克隆进一步进行鉴定(以排除可能存在的假阳性和假阴性克隆);最后将阳性克隆送交测序,测序结果正确后对其进行生物信息学的初步分析,并利用RT 2
2PCR 技术扩增该目的蛋白基因。

克隆出该目的基因之后,还可对其进行进一步的结合特异性、转录激活功能等分析。

其操作步骤如图2所示:
靶基因插入BD 质粒载体
cDNA 文库构建并克隆入AD 质粒载体
共转化酵母感受态细胞阳性克隆的筛选阳性克隆的鉴定阳性克隆的测序
利用RT -PCR 技术从cDNA 文库中扩增目的基因
图2　酵母单杂交系统的技术路线
FIG URE 2　T echnical line of yeast one hybrid system
113　酵母单杂交系统的优缺点
酵母单杂交体系的主要优点在于:①采用酵母单杂交体系能在一个简单的实验过程中,识别与
DNA 特异结合的蛋白质,同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA 序列,而无需分离纯化蛋白,实验操作简单易行。

②由于利用酵母单杂交体系检测到的与DNA 结合的蛋白质是处于天然构象,这就克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点,因而具有很高的灵敏性。

③融合蛋白基因在强启动子的作用下,处于较高的表达水平。

当载体转入宿主菌后,诱导前的扩增、筛选步骤使各个质粒的拷贝数达到最佳程度。

报道基因的复合启动子使其对G A L4特别敏感。

④目前,多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA 文库已经商品化,这为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。

酵母单杂交体系的缺点在于:①有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用,或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录,因此往往产生假阳性结果。

②如果酵母表达的AD 融合蛋白对细胞有毒性,或
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融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达,或融合蛋白发生错误折叠[6],或者不能定位于酵母细胞核内,以及融合的G A L4AD封闭了蛋白上与DNA相互作用的位点,则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶元件的能力,从而产生假阴性结果。

2　酵母单杂交系统在植物基因工程中的应用
211　转录因子基因的克隆
利用特定的顺式作用元件四联体,从构建好的特定cDNA文库中通过酵母单杂交系统筛选与之相互作用的转录因子,通过分析其cDNA克隆,来发现新的转录因子基因。

21111　抗渗透胁迫类转录因子基因的克隆
高盐、干旱、低温等逆境都能够诱导植物体内大量基因的表达,这些基因中有一大类是转录因子,它们可以通过与顺式元件的特异结合或与其他蛋白形成转录复合物来调控下游基因的表达。

DREΠCRT(Dehydration Reponsive E lement,DRE)顺式作用元件,核心序列为T ACCG AC AT,1994年Shinozaki在分析拟南芥rd29A基因的启动子时首次发现了9bp的DRE核心序列,它能对干旱、低温等逆境的基因表达起重要作用,且表达不依赖ABA信号转导途径[7]。

DRE B(Dehydration2Responsive E lement Binding)转录因子,即干旱应答元件结合蛋白质,它能特异结合DREΠCRT顺式作用元件,并激活G US报告基因的转录。

自从Liu等[8]在拟南芥中利用酵母单杂交技术发现了与脱水响应元件DREΠCRT特异结合的转录因子DRE B之后,越来越多的研究者们将研究热点放在了挖掘不同植物的DRE B 类转录因子基因上。

迄今为止,学者们已经分别在盐生植物山菠菜(Atriplex hortensis)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(G lycine max)、银新杨(Populus alba var.pyramidalis)和玉米(Zea mays)中利用酵母单杂交系统发现了新的DRE B类转录因子基因[92213]。

DRE B属于植物的AP2ΠERE BP类转录因子,这些转录因子基因都编码典型DRE B家族具有的ERE BPΠAP2保守结构域的蛋白,并能与DRE元件特异性结合。

它们还可以被盐、干旱或低温等不同逆境诱导转录,并可分别在根、茎、叶等不同组织部位积累。

此后,许多学者进行了这方面的研究,并得到了一些抗渗透胁迫相关的转录因子基因(表1)。

表1　利用酵母单杂交系统获得的植物抗渗透胁迫转录因子基因
T ABLE1　T ranscription factor genes of osm osis resistance type in plants obtained from yeast one hybrid system
转录因子植物学名转录因子类型顺式作用元件参考文献
DRE B Arabidopsis thaliana--Liu,et al.[8]
DRE B Atriplex hortensis--Shen,et al.[9]
DRE B Triticum aestivum AP2ΠERE BP T ACCG ACAT Shen,et al.[10]
DRE B G lycine max--Li,et al.[11]
DRE B Populus alba var.pyramidalis--秦红霞等[12]
DRE B Zea mays--Qin,et al.[13]
J ERF1Nicotiana tabacum AP2ΠERE BP G CC box;DRE Zhang,et al.[14] OP B P1Nicotiana tabacum AP2ΠERE BP G CC2box G uo,et al.[15]
ORC A Catharanthus roseus AP2G CC2box M enke,et al.[16] GhERE B2　GhERE B3G ossypium hir sutum ERE BP G CC2box Duan,et al.[17] JAMYC2Lycoper sicon esculentum bH LH leucine zipper TΠG2box AACG TG Boter,et al.[18] JAMYC10Arabidopsis thaliana bH LH leucine zipper TΠG2box AACG TG Boter,et al.[18] ANAC019　ANAC055　ANAC072Arabidopsis thaliana NAC CATG TG T ran,et al.[19] RAMY Oryza sativa-CXCX(4)CX(2)H Peng,et al.[20]
ARF1Arabidopsis thaliana-TG TCTC Ulmas ov,et al.[21] ZFHD1Arabidopsis thaliana-ZFHDRS T ran,et al.[22]
RCB F2Oryza sativa AP2C2repeatΠDRE Liu,et al.[23]
21112　胚胎发生类转录因子基因的克隆
植物的胚胎发生包括从单个合子发育开始到胚胎成熟,进而进入胚后发育的总过程。

最近几年,人们获得了大量植物胚胎发生的突变体,同时结合分子生物学技术克隆了许多重要基因(特别是转录因子基因),这对研究胚胎发生过程产生了巨大的作用。

Dc3是来自胡萝卜(Daucus carota)Lea(Late Embry ogenesis Abundant)家族的基因,此基因是在体细胞和合子胚胚胎发生阶段大量表达的,且受ABA 的诱导。

K im小组[24]利用一个改进的酵母G A L224单杂交系统克隆了一个与Dc3启动子区域结合的因子。

在一个独立的实验中筛选到25000000个转化子,还从向日葵(Helianthus annun)的cDNA融合表达文库中筛选到与Dc3启动子功能顺式元件特异结合的9个独立的cDNA克隆。

这些克隆的分析表明它们来自于3个不同的编码2种基本亮氨酸拉链蛋白的mRNA。

这些蛋白的基本区域分别被命名为
341
第1期王　琪等:酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的应用
DP BF221(Dc3Prom oter2Binding Factor21)和DP BF222,而且它们都与植物的G22box结合因子G BF224相似。

与其他的bZIP类转录因子不同,DP BF221和DP BF222识别序列包括AC AC NNG的核心序列。

在1998年, K im小组又用同样的方法筛选到了DP BF223蛋白。

DP BF223与DP BF221和DP BF222在其共有碱性区域内是相似的。

DP BF223的分离说明这一小类bZIP转录因子家族参与了Dc3基因的种子特异性表达和ABA响应元件的表达。

系统学分析和DNA结合性研究表明DP BF家族属于一类新的bZIP因子,它们可能对种子特异性基因和ABA响应基因起着全局性的调控作用。

K osugi等[25]也利用酵母单杂交系统从水稻(Oryza sativa)中分离到两个编码与分生组织的特异性表达有关的结合蛋白(PCF1、PCF2)的cDNA。

然而,这些研究大多只停留在克隆转录因子基因与转录因子基因本身特性的探讨中,关于其在调控中的具体作用,以及在胚胎发生中的特定功能还需要进一步的研究。

21113　抗病类转录因子基因的克隆
寄主植物与病原菌相互作用时,病原菌无毒基因表达产物与寄主植物抗病基因编码蛋白相互识别和结合而产生信号分子,这种信号通过一系列信号传递因子或调控因子的传导,最终导致寄主植物细胞特异性抗病防卫反应基因的表达,从而产生抵抗性。

因此,信号转导相关因子在抗病机制研究中占有非常重要的位置。

科学家们已利用各种不同的理化与生物方法从植物中克隆出多个抗病信号转导相关因子,其中酵母单杂交也成为解决这一问题的一个强有力技术手段。

如:胡萝卜苯基丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Amm onia2lyase,P AL)基因在胡萝卜悬浮细胞培养中可以被真菌和UV22B照射而诱导表达。

在DcP AL1基因的启动子区域存在6个序列, box22L0到box22L5。

Maeda等[26]利用酵母单杂交技术,以box22L0到box22L5作为靶序列,筛选到了编码R2R3型MY B转录因子的cDNA,即DcMYB1。

DcMYB1可以在体外,酵母细胞和胡萝卜原生质体中与boxes22L0、L1、L3Π4和L5序列[ACC(AΠT)(AΠT)CC]结合。

在真菌诱导或UV22B照射015h后, DcMYB1的转录表达可以被诱导。

Fischer等[27]从烟草(Nicotiana tabacum)中分离到了一个AP2ΠERF (Eethylene Response Factor)转录因子家族的新成员,命名为NtERF5。

重组的NtERF5蛋白在体外可以与G CC box顺式元件微弱结合,G CC box介导一些与发病相关的病菌诱导基因的转录。

NtERF5的转录可以被机械伤害,丁香假单孢菌(P seudomonas sp.)的感染,以及烟草花叶病毒(T obacco M osaic Virus, T MV)的接种瞬时激活。

可见,转录因子对植物抗病反应的应答启动具有重要的意义,通过植物转基因工程等手段使植物获得抗病抗逆的能力已经成为一种可能。

21114　其他类转录因子基因的克隆
除了前面谈到的几类转录因子外,利用此系统还克隆了很多其他类别的转录因子,这些转录因子涵盖了许多转录因子家族,如MY B[28]类、bH LH[29]类、ASR[30]类等。

其中,Liu等[31]利用酵母单杂交系统在水稻中分离到与热击元件特异相互作用的2个热击因子,OsHSF6和OsHSF12。

推测的氨基酸序列分析表明,OsHSF6属于A类热击因子(HSF),它具有热胁迫类转录因子特征的全部保守序列元件;而OsHSF12是B类热击因子,它在C末端区域缺少AH A基序。

生物信息学分析表明这两个HSFs的DNA结合结构域与LpHSF24具有很高的相似性。

R ose等[28]从番茄(Lycoper sicon esculentum)中分离到一个克隆———LeMYBI,编码LeMYBI的蛋白在第2个myb重叠区含有一个SH AQKY F氨基酸信号结构域,它与最近发现的植物MY B相关基因具有高度的保守性,是一类新的植物DNA结合蛋白家族。

Peng 等[32]克隆到一个参与植物抵御紫外光的编码泛肽交联酶(E2)基因。

氨基酸同源性分析表明,该酶E2 (RE2)与其他物种的泛肽交联酶具有很高的同源性。

Birsen等[30]从葡萄中克隆得到了一个ASR (ABA2,Stress2,and Ripening2induced)类蛋白(功能未知)VvMS A,它在糖和ABA的信号转导中作为一个转录调控复合物起作用。

Qian等[29]近期发表了他们小组的研究结果,以P sCH S1启动子上的G2box 顺式元件为诱饵,从谷胱甘肽诱导的豌豆(Pisum sativum)cDNA文库中克隆到新的bH LH(Basic Helix2 Loop2Helix)类蛋白PsG BF。

凝胶阻滞电泳和β22gal 实验发现PsG BF具有与G22box特异的结合能力以及转录激活功能。

212　确定已知DNA22蛋白质的相互作用
最初,这部分的应用主要集中在验证克隆的新转录因子基因是否能与顺式元件在酵母体内的结合上,即只是作为基因克隆中后续工作(功能分析)的一部分。

如:Y oshihiro等[33]以拟南芥(Arabidopsis thaliana)根表皮细胞分化为模式系统来研究胚胎发生过程中的细胞特异性。

通过酵母单杂交实验和凝胶阻滞电泳来验证克隆的新转录因子基因是否能与顺式元件结合,结果发现,R2R322型MY B蛋白WEREW O LF(WER),可以直接与CPC基因上一个69bp的序列结合。

并发现WER也可以与G L2启
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动子区域结合,表明WER能够通过与CPC和G L2启动子区域结合来直接调控它们的转录。

Chung 等[34]也做了类似的工作,他们从水稻悬浮细胞的cDNA中分离到3个新的MY B蛋白,分别命名为OsMY BS1、OsMY BS2和OsMY BS3。

凝胶阻滞实验表明,它们在体外均可以和T AT CC A元件特异结合。

酵母单杂交实验显示,OsMY BS1、OsMY BS2可以在体内与T AT CC A元件结合,并可以转录激活含T AT CC A元件的启动子的表达。

不同的是,Chung小组在此结果的基础上,进一步利用酵母双杂交技术,证明了OsMY BS1能够形成二聚体。

最后得出,不同的DNA结合亲和力、启动子的转录激活能力、二聚体的形成,以及与其他蛋白因子的相互作用决定了OsMY BSs的生物学功能。

这为OsMY BSs生物学功能的最终确定奠定了坚实基础。

近年来,应用单杂交系统确定已知DNA22蛋白质的相互作用有了更为广泛的应用,如以目的蛋白与DNA之间在真核生物体内相互作用的确认为前提,进行下一步蛋白生理功能的推断和研究。

Shimada[35]等在研究石竹科植物的花青素生物合成基因的转录调控时发现,牵牛花(Petunia hybrida)中调控花青素合成的AN2(PhAN2)和JAF13 (Ph JAF13)蛋白能与菠菜(Spinacia oleracea)种子特异表达的2个基因DFR(Dihydroflav onol42 reductase)、ANS(Anthocyanidin Synthase)的启动子区域发生相互作用。

进一步结合目的蛋白(AN2和JAF13)在不同物种中的瞬时表达实验,结果表明: AN2和JAF13只与特定物种(菠菜)的目的DNA发生作用,从而阻断其随后的生理过程(花青素合成)。

而AN2和JAF13与其他物种的目的DNA都能发生相互作用,从而启动其调控的花青素合成。

Ren 等[36]报道了包含BT B、T AZ和钙调蛋白结构域的BT2蛋白是拟南芥转录因子T AC1(T elomerase Activator1)介导的端粒末端转移酶(T elomerase)激活途径的重要组分。

当T AC1表达时,BT2mRNA的含量也稳步增加;而且T AC1可以与BT2启动子在体外特异结合,也可以通过酵母单杂交技术验证其在体内的特异结合性。

BT2的组成型表达可以诱导叶片中的telomerase活性,而BT2的一个无效突变阻断了T AC1介导的telomerase的诱导,表明在成熟的营养器官中BT2在T AC1的下游调控telomerase的活性。

此研究利用酵母单杂交确定了转录因子T AC1与BT2启动子的体内结合特异性,作为转录因子功能研究的一个方面。

213　已知具有相互作用的DNA结合结构域的定位鉴定和定位已知的具有相互作用的DNA结合结构域,最初是通过酵母双杂交系统来实现的,直到现在,双杂交技术在这方面的应用仍很多,如: Chakraborty[37]等用双杂交的方法研究了蛋白磷酸酶PP2C家族和蛋白激酶S OS2家族的相互作用,从而找到在不同植物的蛋白激酶中与PP2C结构域相互作用的识别位点。

目前,通过酵母单杂交体系进行结构域定位的报道也越来越多。

如大量真核基因的5′上游区域具有包含CC AAT核心序列的顺式作用元件,与CC AAT结合的因子通过与这些顺式作用元件相互作用形成一个复合物,从而调控基因的转录。

CC AAT结合因子包括至少3个亚基,每个独立的亚基不能与CC AAT box结合。

Y ao等[38]利用酵母单杂交系统以及功能互补实验证明CC AAT结合因子是水稻RAP B的cDNA,与酵母的H AP2(CC AAT结合因子的一个亚基)同源。

氨基酸分析表明,推测的RAP B的C末端氨基酸序列也包括与酵母H AP2高度同源的60个氨基酸的功能区,但推测出的N末端氨基酸却与酵母H AP2有显著差异。

Liu等[39]从烟草中分离出2条DRE B类转录因子基因,分别命名为NbDRE B1和NbDRE B2。

根据测序结果推导出的序列分析显示,NbDRE B1和NbDRE B2都具有典型的AP2ΠERE BP转录因子家族ERE BP亚族A类特征。

连接p G ADT7反式激活载体形成融合基因表达结果显示,NbDRE B1能与DRE顺式作用元件结合, NbDRE B2则不能。

比较NbDRE B1和NbDRE B2的AP2区,发现两者的第2和49位氨基酸残基不同。

当把NbDRE B2的第2位氨基酸残基N点突变为Y, NbDRE B2也显示出与DRE顺式元件结合的活性,表明烟草DRE B转录因子的AP2区第2位氨基酸残基Y是识别及结合DRE顺式作用元件所必需的。

214　转录激活作用的验证
在酵母单杂交系统中,若判断一个转录因子是否具有转录激活活性,可以将其只与G A L4结合结构域融合,再将融合后的载体转入到酵母细胞内,如果能够激活酵母体内报告基因的表达,就可以确认此转录因子的转录激活功能。

如:Cup2shaped cotyledon(CUC)1和CUC2是编码NAC蛋白基序的胚胎发生类基因。

T aoka等[40]分析了这些基因活动的分子基础。

核定位分析表明,绿色荧光蛋白(G reen Fluorescent Protein,G FP)22C UC蛋白可以在细胞核中积累。

酵母单杂交和瞬时表达实验证明CUC的C22末端区域具有转录激活功能。

Shukla
等[41]从鹰嘴豆(Cicer arietinum)中分离到一个新的编码AP2家族转录因子的基因C A P2。

重组的C AP2蛋白可以与C2repeatΠDRE元件在体外特异结合,通
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第1期王　琪等:酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的应用
过酵母单杂交实验验证了其可以转录激活报告基因。

从而表明C AP2在植物的生长发育和渗透胁迫信号转导途径中发挥了巨大作用。

然而,并不是所有克隆出的转录因子都具有相应的转录激活功能。

Wei等[42]从拟南芥幼苗中分离到一个可以快速受ABA、低温、干旱、机械损伤和轻度高盐处理诱导的cDNA,将它归类于DRE B亚家族成员,并命名为TINY2。

凝胶阻滞实验表明TI NY2能够与DRE元件形成一个特异的复合体,但是它只与G CC box有微弱的亲和力。

酵母单杂交实验表明,当TI NY2与G A L4DNA结合域融合时,其全长序列和C末端都没有有效的作为一个反式激活子起作用,而其N末端则完全失活,说明其并不具有转录激活活性。

3　存在问题与展望
目前有关植物调控逆境胁迫和生长发育的研究重点逐渐从功能基因转到顺式作用元件和转录因子的鉴定、功能分析及其调控机理等方面。

然而,国内外的植物学家们仍将大部分的注意力集中在利用酵母单杂交系统寻找与特定顺式元件结合的转录因子基因上,特别是挖掘与植物抗逆有关的转录因子上(如对DRE B反式作用因子基因的克隆[82213])。

植物的抗逆信号转导途径是一个相当复杂的过程,这一过程需要很多的受体蛋白、激酶、转录因子的协同作用,这就需要研究者们不仅仅克隆一些重要的转录因子基因,更要从植物的整体全局来考虑,找到信号转导途径中每个关键的组分,为进一步阐明植物的生长发育和抗性机理奠定分子和生化基础。

本课题组即以拟南芥中耐寒转录因子基因CB F2上游的特定顺式元件ICEr2为“诱饵”,利用酵母单杂交系统克隆与之结合的转录因子———即寻找转录因子基因的转录因子,渴望通过挖掘调控渗透胁迫反应的“开关”之“开关”,最后找到引领全局的“总开关”,为完善植物渗透胁迫信号转导途径和渗透胁迫相关应答机制的研究奠定理论基础。

目前我们的工作正在进行当中。

参考文献
[1]LI J J,HERSK OWITZ I.Is olation of ORC6,a com ponent of the
yeast origin recognition com plex by a one2hybrid system[J].
Science,1993,262(5):1870221873.
[2]胡振林,孙树汉,戴建新,等.应用酵母单杂交系统筛选C p G
免疫激活序列的特异性结合蛋白[J].第二军医大学学报,
2001,22(6):542225451
HU Z L,S UN S H,DAI J X,et al.Screening out C p G
immunostimulatory sequence2specific DNA2binding proteins with
yeast2one2hybrid system[J].Journal o f Second Military Medica
Univer sity,2001,22(6):542225451[3]黄建,侯春晖,钱若兰.用酵母单杂交系统筛选与人ε222珠
蛋白基因表达相关的基因[J].生物化学与生物物理学报, 2001,33(2):246222501
HUANGJ,HOU C H,QIAN R L.Screening of genes related to the expression of humanε2globin gene by using yeast one2hybrid system [J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2001,33(2):24622 2501
[4]LIU J D,WI LS ON T F,MI LBRANDT J,et al.Identifying DNA2
binding sites and analyzing DNA2binding domains using a yeast selection system[J].Methods,1993,57(5):125221371
[5]巨立中,成军,钟彦伟.启动子DNA结合蛋白研究策略[J].
世界华人消化杂志,2004,12(1):141221421
JU L Z,CHE NGJ,ZHONG Y W.The strategies of DNA binding protein on prom oter[J].World Journal o f Chinese Assimilation, 2004,12(1):141221421
[6]廖名湘,方福德.酵母单杂交体系———一种研究DNA22蛋白
质相互作用的有效方法[J].中国医学科学院学报,2000,22
(4):379223911
LIAO M X,FANG F D.Y east one2hybrid system—one effective method studying DNA2protein interaction[J].Acta Academiae Medinae Sinicae,2000,22(4):379223911
[7]SHINOZ AKI K,Y AM AG UCHI2SHINOZ AKI K.G ene expression and
signal transduction in waterress response[J].Plant Physiol,1997, 115(1):327223341
[8]LIU Q,MIE K,Y OH S,et al.T w o transcription factors,DRE B1
and DRE B2,with an ERE BPΠAP2DNA binding domain separate tw o cellular signal transduction pathways in drought2and low2 tem perature2responsive gene expression,perspectively,in Arabidopsis[J].Plant Cell,1998,224(10):139******** [9]SHE N Y G,HANG W K,Y AN D Q,et al.Characterization of a
DRE2binding transcription factor from a halophyte Atriplex hortensis [J].Theoretical and Applied G enetics,2003,107(1):155221611 [10]SHE N Y G,ZHANG W K,HE S J,et al.An ERE BPΠAP22type
protein in Triticum aestivum was a DRE2binding transcription factor induced by cold,dehydration and ABA stress[J].Theoretical and Applied G enetics,2003,106(5):923229301
[11]LI X P,TIAN A G,LUO G Z,et al.S oybean DRE2binding
transcription factors that are responsive to abiotic stresses[J].Theor Appl G enet,2005,110(8):135********
[12]秦红霞,贾志平,张海超,等.银新杨中与DRE结合的转录
因子的克隆与特性分析[J].中国生物工程学报,2005,21
(6):906229101
QIN H X,J IA Z P,ZHANG H C,et al.Is olation and characterization of a DRE2binding transcription factor from Y inxin poplar(Populus alba×P.alba var.pyramidalis)[J].Chinese Journal o f Bioengineering,2005,21(6):906229101
[13]QIN F,S AK UM A Y,LI J,et al.Cloning and functional analysis of
a novel DRE B1ΠC BF transcription factor inv olved in cold2responsive
gene expression in Zea mays L.[J].Plant Cell Physiol,2004,45
(8):10422210521
[14]ZHANG H,HUANG Z,XIE B,et al.The ethylene2,jasm onate2,
abscisic acid2and NaCl2responsive tomato transcription factor J ERF1 m odulates expression of G CC box2containing genes and salt tolerance in tobacco[J].Planta,2004,220(2):262222701
641北　京　林　业　大　学　学　报第30卷　。