利用酵母双杂交系统鉴定 MIF 与CD74 胞外片段间的相互作用
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Taqplus%DNA 聚合酶购自上海生工公司，琼脂糖 凝胶 DNA 提取试剂盒购自 Qiagen 公司，限制性内切 酶 (%EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ) %、DNA%相对分子质量和 DNA 连 接 反 应 液 购 自 TaKaRa （大 连 ）公 司 。 LiAC、 PEG4000 购 自 Sigma 公 司 。 X-α-Gal、SD/-Trp、SD/-% Trp-His、SD/-leu、SD/-leu-His、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-% Leu-Ade-His 购自 CLONTECH 公司。 1.3%%MIF 片段的重组诱饵质粒的构建
根据 MIF 的结构特点［8］，分别构建全长和 2 个截 短的片段：MIF50-65 和 MIF1-50/65-115（图 1）。根据人 MIF 编
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
码序列和 pGBKT7 载体的多克隆位点序列，设计、合 成相应的 PCR 引物（表 1）。 用已构建的 MIF 重组质 粒 pGBKT7-MIF ［9］为 模 板 ， 分 别 用 相 应 的 引 物 扩 增 MIF50-65 （Pf1+Pr1）、MIF1-50 （Pf2+Pr2） 和 MIF65-115 （Pf3+Pr3） 片 段。 PCR 反应条件如下：94%℃，25%s；56%℃，20%s；72%℃， 20%s，共 32 个循环；72%℃延伸 5%min，4%℃终止。 参照我 们已报道的方法 ， ［10］ 以扩增的 MIF1-50 和 MIF65-115 片段 为模板，PCR 扩增 MIF1-50/65-115 片段 （Pr2 与 Pf3 有 20 个 反 向 互 补 的 碱 基 序 列 ， 所 以 MIF1-50 的 3' 末 端 和 MIF65-115 的 5' 末端含相同 20%bp 的碱基序列），方法如 下：以 MIF1-50 和 MIF65-115%DNA 片段为底物，94%℃，25%s， 58%℃，40%s，72%℃，40%s，进行 3 个循环，之后加入引物 Pf2 和 Pr3，94%℃，20%s，56%℃，20%s；72%℃，30%s， 进 行 31 个循环，72%℃延伸 5%min，4%℃终止。
·2384%%·%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报(J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 29 卷
2009;29(12)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报(J%South%Med%Univ)
·2383·
利用酵母双杂交系统鉴定 MIF 与 CD74 胞外片段间的相互作用
单志新，林秋雄，邓春玉，谭虹虹，邝素娟，肖定璋，朱杰宁，符永恒，余细勇（广东省人民医院医学研究中心 / 广 东省心血管病研究所，广东 广州 510080）
种自身免疫和炎症疾病的病理过程， 包括关节炎 ［2］、 肾小球肾炎 ［3］、革兰氏阳性和革兰氏阴性脓毒 ［4］及动 脉粥样硬化［5］等。Leng［6］等报道，MIF 可与Ⅱ型穿膜蛋 白 CD74 的胞外片段结合进行信号传导。 我们克隆了 人 CD74 胞外片段的基因编码序列，并在大肠杆菌中 表达出具有生物活性的重组 CD74 蛋白；体外血管生 成实验结果显示，重组 CD74 蛋白能特异地阻断 MIF 的促血管生成作用［7］。 为了能够利用较小的 CD74 胞
摘要：目的 利用酵母双杂交系统鉴定巨噬细胞移动抑制因子（MIF）与Ⅱ型穿膜蛋白 CD74 胞外片段间可能的相互作用 区 域 。 方 法 利 用 分 子 克 隆 技 术 ， 分 别 构 建 以 pGBKT7 为 载 体 的 人 全 长 MIF、MIF50-65、MIF1-50/65-115 的 重 组 诱 饵 质 粒 ，以 pGADT7为载体的人 CD7473-232、CD7473-109、CD74109-149、CD74149-232 的重组激活域（AD）质粒。 用 PEG/LiAC 法将上述重组诱 饵 质 粒 分 别 与 重 组 AD 质 粒 两 两 共 转 化 感 受 态 酵 母 菌 AH109， 分 别 观 察 在 SD/-Trp-Leu、 含 X-α-gal 的 SD/-Trp-Leu-Ade-His 培养基上生长情况。 结果 限制性内切酶酶切和 DNA 测序证实所构建的重组质粒全部正确。3 种 重组诱饵质粒转化的酵母菌 AH109 均可在 SD/-trp 上生长，4 种重组 AD 质粒转化的酵母菌 AH109 均 可 在 SD/-leu 上 生长，而且上述转化的酵母菌 AH109 均无自身转录激活活性。 只有 MIF、MIF50-65、MIF1-50/65-115 与 CD7473-232 表达质粒 共 转 化的酵母菌 AH109 可在 SD/-Trp-Leu-Ade-His 培养基上生长，能激活 MEL1 报告基因 ，使 X-α-gal 变 蓝 。 结 论 MIF 能 以功能域 MIF50-65 非依赖性方式与完整的 CD74 胞外片段相互结合，进行细胞信号转导。 关 键 词 ：酵 母 双 杂 交 ；巨 噬 细 胞 移 动 抑 制 因 子 ；CD74；蛋 白 质 相 互 作 用 ；克 隆 ,%分 子 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2009)12-2383-04
Abstract: Objective To%investigate%the%interaction%domains%between%macrophage%migration%inhibitory%factors%(MIF)%and%the% extracellular%segment%of%type-II%trans-membrane%protein%CD74%using%a%yeast%two-hybrid%system. %Methods By%using%molecular% cloning%techniques, %the%DNA%fragments%encoding%MIF, %MIF % 50-65 and%MIF1-50/65-115%were%introduced%into%the%pGBKT7%vector%to% construct%the%corresponding%recombinant%bait%plasmids,%and%the%DNA%fragments%encoding%CD74 73-232,%CD7473-109,%CD741109-149%and% CD74149-232% into% the% pGADT7% vector% to% construct% the% recombinant% activation% domain% (AD) % plasmids. % PEG/LiAC% method% was% employed% to% transform% the% above% 3% recombinant% bait% plasmids% paired% with% each% of% the% 4% recombinant% AD% plasmids% into% the% chemical%competent%yeast%AH109%cells.%The%transformed%yeast%AH109%cells%were%screened%consecutively%on%SD/-Trp-Leu%and% SD/-Trp-Leu-Ade-His/X-α-gal% nutritional% media. % Results The% results% of% restriction% endonuclease% digestion% and% DNA% sequencing%verified%the%correct%construction%of%all%the%recombinant%plasmids. %The%yeast%AH109%cells%transformed%with%each%of% the%3%recombinant%bait%plasmids%could%grow%on%SD/-trp%nutritional%media%without%autonomous%activation%effect%on%the%reporter% gene%MEL1. %The%cells%transformed%with%each%of%the%4%recombinant%AD%plasmids%could%also%grow%on%SD/-leu%nutritional%media% without%activation%of%the%reporter%gene%MEL1. %Only%the%yeast%AH109%cells%co-transformed%with%MIF, %MIF , 50-65 %or%MIF1-50/65-115% plasmid% and% CD7473-232% plasmid% could% grow% on% SD/-Trp-Leu-Ade-His% nutritional% media% with% transcription% activation% of% the% reporter%gene%MEL1.%Conclusion MIF%interacts%with%the%intact%extracellular%segment%of%CD74%(CD74 ) 73-232 %independent%of%the% functional%domain%of%MIF50-65. Key words: yeast%two-hybrid%system;%macrophage%migration%inhibitory%factor;%CD74;%protein%interaction;%cloning,%molecular
巨噬细胞 移 动 抑 制 因 子 （MIF）是 较 早 发 现 的 淋 巴细胞因子之一，能够抑制巨噬细胞游走，引起巨噬 细胞在迟发型变态反应中浸润、聚集［1］。 MIF 参与多
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 收 稿 日 期 ：2009-06-18 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （30300421，30672077）； 广 东 省 自 然 科 学 基 金 （06020831） 作 者 简 介 ： 单 志 新 （1972-）， 男 ， 副 研 究 员 ， 主 要 从 事 医 学 分 子 生 物 学 研 究 ， 电 话 ：020-83827812-51152，E-mail:%zhixinshan@
Identification of the interactions between the truncated fragments of macrophage migration inhibitory factor and CD74 using a yeast two-hybrid system
SHAN%Zhi-xin,%LIN%Qiu-xiong,%DENG%Chun-yu,%TAN%Hong-hong,%KUANG%Su-juan,%XIAO%Ding-zhang,%ZHU%Jie-ning,%FU%Yong-heng,% YU%Xi-yong Research% Center% of% Medical% Sciences, % Guangdong% Provincial% People's% Hospital, % Guangzhou/Guangdong% Provincial% Cardiovascular% Disease%Institute,%Guangzhou%510080,%China
外片段来抑制 MIF 的生物学活性， 本研究将采用酵 母双杂交系统来鉴定 MIF 与 CD74 胞外片段间可能 的相互作用区域。
1%%材料和方法 1.1%%菌株、质粒及细胞
大 肠 杆 菌 （E.coli）DH5α 为 本 室 保 存 ，穿 梭 质 粒 pGBKT7 、pGADT7 、pGBKT7-Lamc 、pGBKT7-p53 、 pGADT7-T 和 酵 母 菌 AH109 购 于 CLONTECH 公 司。 1.2%%主要试剂
根据 MIF 的结构特点［8］，分别构建全长和 2 个截 短的片段：MIF50-65 和 MIF1-50/65-115（图 1）。根据人 MIF 编
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
码序列和 pGBKT7 载体的多克隆位点序列，设计、合 成相应的 PCR 引物（表 1）。 用已构建的 MIF 重组质 粒 pGBKT7-MIF ［9］为 模 板 ， 分 别 用 相 应 的 引 物 扩 增 MIF50-65 （Pf1+Pr1）、MIF1-50 （Pf2+Pr2） 和 MIF65-115 （Pf3+Pr3） 片 段。 PCR 反应条件如下：94%℃，25%s；56%℃，20%s；72%℃， 20%s，共 32 个循环；72%℃延伸 5%min，4%℃终止。 参照我 们已报道的方法 ， ［10］ 以扩增的 MIF1-50 和 MIF65-115 片段 为模板，PCR 扩增 MIF1-50/65-115 片段 （Pr2 与 Pf3 有 20 个 反 向 互 补 的 碱 基 序 列 ， 所 以 MIF1-50 的 3' 末 端 和 MIF65-115 的 5' 末端含相同 20%bp 的碱基序列），方法如 下：以 MIF1-50 和 MIF65-115%DNA 片段为底物，94%℃，25%s， 58%℃，40%s，72%℃，40%s，进行 3 个循环，之后加入引物 Pf2 和 Pr3，94%℃，20%s，56%℃，20%s；72%℃，30%s， 进 行 31 个循环，72%℃延伸 5%min，4%℃终止。
·2384%%·%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报(J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 29 卷
2009;29(12)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报(J%South%Med%Univ)
·2383·
利用酵母双杂交系统鉴定 MIF 与 CD74 胞外片段间的相互作用
单志新，林秋雄，邓春玉，谭虹虹，邝素娟，肖定璋，朱杰宁，符永恒，余细勇（广东省人民医院医学研究中心 / 广 东省心血管病研究所，广东 广州 510080）
种自身免疫和炎症疾病的病理过程， 包括关节炎 ［2］、 肾小球肾炎 ［3］、革兰氏阳性和革兰氏阴性脓毒 ［4］及动 脉粥样硬化［5］等。Leng［6］等报道，MIF 可与Ⅱ型穿膜蛋 白 CD74 的胞外片段结合进行信号传导。 我们克隆了 人 CD74 胞外片段的基因编码序列，并在大肠杆菌中 表达出具有生物活性的重组 CD74 蛋白；体外血管生 成实验结果显示，重组 CD74 蛋白能特异地阻断 MIF 的促血管生成作用［7］。 为了能够利用较小的 CD74 胞
摘要：目的 利用酵母双杂交系统鉴定巨噬细胞移动抑制因子（MIF）与Ⅱ型穿膜蛋白 CD74 胞外片段间可能的相互作用 区 域 。 方 法 利 用 分 子 克 隆 技 术 ， 分 别 构 建 以 pGBKT7 为 载 体 的 人 全 长 MIF、MIF50-65、MIF1-50/65-115 的 重 组 诱 饵 质 粒 ，以 pGADT7为载体的人 CD7473-232、CD7473-109、CD74109-149、CD74149-232 的重组激活域（AD）质粒。 用 PEG/LiAC 法将上述重组诱 饵 质 粒 分 别 与 重 组 AD 质 粒 两 两 共 转 化 感 受 态 酵 母 菌 AH109， 分 别 观 察 在 SD/-Trp-Leu、 含 X-α-gal 的 SD/-Trp-Leu-Ade-His 培养基上生长情况。 结果 限制性内切酶酶切和 DNA 测序证实所构建的重组质粒全部正确。3 种 重组诱饵质粒转化的酵母菌 AH109 均可在 SD/-trp 上生长，4 种重组 AD 质粒转化的酵母菌 AH109 均 可 在 SD/-leu 上 生长，而且上述转化的酵母菌 AH109 均无自身转录激活活性。 只有 MIF、MIF50-65、MIF1-50/65-115 与 CD7473-232 表达质粒 共 转 化的酵母菌 AH109 可在 SD/-Trp-Leu-Ade-His 培养基上生长，能激活 MEL1 报告基因 ，使 X-α-gal 变 蓝 。 结 论 MIF 能 以功能域 MIF50-65 非依赖性方式与完整的 CD74 胞外片段相互结合，进行细胞信号转导。 关 键 词 ：酵 母 双 杂 交 ；巨 噬 细 胞 移 动 抑 制 因 子 ；CD74；蛋 白 质 相 互 作 用 ；克 隆 ,%分 子 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2009)12-2383-04
Abstract: Objective To%investigate%the%interaction%domains%between%macrophage%migration%inhibitory%factors%(MIF)%and%the% extracellular%segment%of%type-II%trans-membrane%protein%CD74%using%a%yeast%two-hybrid%system. %Methods By%using%molecular% cloning%techniques, %the%DNA%fragments%encoding%MIF, %MIF % 50-65 and%MIF1-50/65-115%were%introduced%into%the%pGBKT7%vector%to% construct%the%corresponding%recombinant%bait%plasmids,%and%the%DNA%fragments%encoding%CD74 73-232,%CD7473-109,%CD741109-149%and% CD74149-232% into% the% pGADT7% vector% to% construct% the% recombinant% activation% domain% (AD) % plasmids. % PEG/LiAC% method% was% employed% to% transform% the% above% 3% recombinant% bait% plasmids% paired% with% each% of% the% 4% recombinant% AD% plasmids% into% the% chemical%competent%yeast%AH109%cells.%The%transformed%yeast%AH109%cells%were%screened%consecutively%on%SD/-Trp-Leu%and% SD/-Trp-Leu-Ade-His/X-α-gal% nutritional% media. % Results The% results% of% restriction% endonuclease% digestion% and% DNA% sequencing%verified%the%correct%construction%of%all%the%recombinant%plasmids. %The%yeast%AH109%cells%transformed%with%each%of% the%3%recombinant%bait%plasmids%could%grow%on%SD/-trp%nutritional%media%without%autonomous%activation%effect%on%the%reporter% gene%MEL1. %The%cells%transformed%with%each%of%the%4%recombinant%AD%plasmids%could%also%grow%on%SD/-leu%nutritional%media% without%activation%of%the%reporter%gene%MEL1. %Only%the%yeast%AH109%cells%co-transformed%with%MIF, %MIF , 50-65 %or%MIF1-50/65-115% plasmid% and% CD7473-232% plasmid% could% grow% on% SD/-Trp-Leu-Ade-His% nutritional% media% with% transcription% activation% of% the% reporter%gene%MEL1.%Conclusion MIF%interacts%with%the%intact%extracellular%segment%of%CD74%(CD74 ) 73-232 %independent%of%the% functional%domain%of%MIF50-65. Key words: yeast%two-hybrid%system;%macrophage%migration%inhibitory%factor;%CD74;%protein%interaction;%cloning,%molecular
巨噬细胞 移 动 抑 制 因 子 （MIF）是 较 早 发 现 的 淋 巴细胞因子之一，能够抑制巨噬细胞游走，引起巨噬 细胞在迟发型变态反应中浸润、聚集［1］。 MIF 参与多
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 收 稿 日 期 ：2009-06-18 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （30300421，30672077）； 广 东 省 自 然 科 学 基 金 （06020831） 作 者 简 介 ： 单 志 新 （1972-）， 男 ， 副 研 究 员 ， 主 要 从 事 医 学 分 子 生 物 学 研 究 ， 电 话 ：020-83827812-51152，E-mail:%zhixinshan@
Identification of the interactions between the truncated fragments of macrophage migration inhibitory factor and CD74 using a yeast two-hybrid system
SHAN%Zhi-xin,%LIN%Qiu-xiong,%DENG%Chun-yu,%TAN%Hong-hong,%KUANG%Su-juan,%XIAO%Ding-zhang,%ZHU%Jie-ning,%FU%Yong-heng,% YU%Xi-yong Research% Center% of% Medical% Sciences, % Guangdong% Provincial% People's% Hospital, % Guangzhou/Guangdong% Provincial% Cardiovascular% Disease%Institute,%Guangzhou%510080,%China
外片段来抑制 MIF 的生物学活性， 本研究将采用酵 母双杂交系统来鉴定 MIF 与 CD74 胞外片段间可能 的相互作用区域。
1%%材料和方法 1.1%%菌株、质粒及细胞
大 肠 杆 菌 （E.coli）DH5α 为 本 室 保 存 ，穿 梭 质 粒 pGBKT7 、pGADT7 、pGBKT7-Lamc 、pGBKT7-p53 、 pGADT7-T 和 酵 母 菌 AH109 购 于 CLONTECH 公 司。 1.2%%主要试剂