茶树茶氨酸合成相关酶基因研究

茶树茶氨酸合成相关酶基因研究
赵洋;刘振;杨培迪;成杨;杨阳
【摘要】Theanine is the characteristic nonprotein amino acid in tea
tree .This paper described the distribution and variation characteristics of theanine in tea tree , summed up the research status of the synthetic pathways of theanine as well as the enzyme genes related to the synthesis of theanine in tea tree , and discussed its research contents and direction in the future .%茶氨酸是茶树特征性非蛋白质氨基酸。

阐述了茶氨酸在茶树体内的分布及变化特点，总结了茶氨酸合成途径及茶氨酸合成相关酶基因的研究现状，并对今后的研究内容及方向进行了展望。

【期刊名称】《江西农业学报》
【年(卷),期】2015(000)004
【总页数】4页(P70-73)
【关键词】茶;茶氨酸;代谢;酶;基因
【作者】赵洋;刘振;杨培迪;成杨;杨阳
【作者单位】湖南省茶叶研究所，湖南长沙 410125;湖南省茶叶研究所，湖南长沙 410125;湖南省茶叶研究所，湖南长沙 410125;湖南省茶叶研究所，湖南长沙410125;湖南省茶叶研究所，湖南长沙 410125
【正文语种】中文
【中图分类】S571.1
Key words： Tea tree; Theanine; Metabolism; Enzyme; Gene
茶氨酸(Theanine，N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶树特有的生化成分，除茶树外目前仅在茶梅和蕈
[1-3]中检测到该物质，是一种非蛋白氨基酸。

茶氨酸是茶树体内主要的游离氨基酸，在新梢芽叶中，茶氨酸约占游离氨基酸总量的40%~70%，茶叶干重的1%~2%
[4]。

茶氨酸口感鲜爽，对绿茶口味有显著影响，是绿茶品质鉴定时的重要指标
[5-6]。

大量研究结果表明：茶氨酸具有保健功能和药理作用，如镇静、抗癌、加强免疫、降压降脂等功效
[7]，成为茶叶开发利用的热点。

茶树中茶氨酸的生理作用现在仍不明确，普遍认为其是茶树体内可溶氮的存在和储藏形式，参与无毒形态的氮储存和转运，茶氨酸代谢与茶树氮代谢密切相关
[8]。

过量的铵对于一些植物具有毒害作用，茶树是耐铵作物，当土壤中铵过量时，通过合成茶氨酸，缓解毒害
[9]。

科学家们寻找茶氨酸代谢途径中的关键基因，探讨了茶氨酸合成的分子机制及调控机理，试图为高茶氨酸资源鉴定与品种选育提供参考，以及通过技术调控提高茶树茶氨酸含量。

本文主要对茶树茶氨酸合成途径中相关酶基因的研究现状进行了总结，并对今后的研究内容及方向提出了展望，以期对以后的茶氨酸合成代谢机制研究及技术调控探索有所帮助。

茶氨酸在茶树体内分布广泛，存在于果实以外的各器官，幼叶>根皮>吸收根>老叶>茎皮及根、茎木质部
[10]，茶氨酸合成位点目前还未最终确定。

起初认为茶氨酸只在根部合成
[11-13]，后采用
14C标记的谷氨酸作为供体，能够检测到茶树叶部与根部的外植体均能合成茶氨酸
[14]，现在普遍认为茶氨酸主要在根部合成，再通过茎转运至叶部
[15-16]。

茶树新梢萌发前，氨态氮主要以茶氨酸、谷氨酰胺和精氨酸贮存于根部和叶部，茶树萌发时再转移到新梢，此时根部和叶部的茶氨酸含量最高
[17-20]。

3月中旬至5月中旬，新芽中茶氨酸含量从2.3%增加到3.2%；9月初嫩茎和秋梢中茶氨酸从1.7%下降到0.2%；当茶树各部位谷氨酰胺含量增加时，茶氨酸主要在根部积累；冬季茶树根部积累了2.9%~3.5%的茶氨酸，3~4月萌发期，根部茶氨酸含量降低并保持较低含量直到8月，表明茶氨酸转移到了新
梢中
[19]。

从新芽萌发至第1叶长出，茎中茶氨酸含量不断降低，后又随叶片
生长而增加
[21]。

茶树体内乙胺和谷氨酸在茶氨酸合成酶作用下生成茶氨酸
[11,22]。

乙胺作为茶氨酸的合成前体物质，在茶树根部由丙氨酸脱羧酶将丙氨酸脱去羧基生成
[12]。

谷氨酸主要由谷氨酰胺合成酶/谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶(GS/GOGAT)同化胺形成，转运至叶部后在茶氨酸水解酶作用下降解为谷氨酸和乙胺
[23](图1)。

与茶氨酸合成相关的酶有茶氨酸合成酶、谷丙转氨酶
[24]、丙氨酸脱羧酶
[13]、谷氨酸脱氢酶
[25]、谷氨酰胺合成酶/谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶(亦称谷氨酸合酶) [17,26-27]。

目前，对茶氨酸合成途径中的茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶、谷氨酸脱氢酶4个酶的基因进行了克隆，具体见表1。

茶氨酸合成酶(TS，EC 6.3.1.6)即L-谷氨酸-乙胺连接酶，是茶氨酸合成的关键酶，催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸，由Konishi S等
[28]在1963年发现。

2006年，有研究者从茶树嫩叶cDNA文库中筛选
到2条茶氨酸合成酶基因序列，在大肠杆菌中过表达纯化蛋白后用Sasaoka K等
[11]的方法进行测定，证实具有茶氨酸合成能力，分别定义为茶氨酸合成
酶的2个亚型
TS
1和TS
2
[28]。

茶树
TS基因的表达存在组织差异，
TS
1基因在新梢中表达量最高，根部相对较低；TS
2基因在新梢和根系中表达量相同
[29]。

李娟等
[30]克隆了安吉白茶的
TS基因，并通过亚细胞定位预测，表明该TS是一种细胞质蛋白。

陈琪对T
1代转
TS
1基因的拟南芥根部进行了细胞定位，融合的
GFP基因在胞质中表达，表明
TS
1主要位于细胞质内
[31]。

TS
1基因经原核表达后的蛋白能够催化谷氨酰胺与盐酸乙胺合成茶氨酸，而不能催化谷氨酸与盐酸乙胺合成茶氨酸；NO处理水培茶苗后，叶和根部的茶氨酸含量均增加，且根部增加显著，Western Blotting结果显示叶和根部的
TS
1含量均增加，根部尤其明显
[31]。

茶籽苗经NaCl处理后，Western Blotting显示根部和叶部
TS的表达量随茶氨酸含量的增加而逐步增加
[32]。

在添加盐酸乙胺的茶树愈伤组织中，3~12 d的茶氨酸含量几乎呈线性增加，实时荧光定量PCR显示：初始3 d，
TS
2基因表达量较对照组增加明显，与茶氨酸含量增加相一致，而
TS
1基因表达量在对照组和处理组之间无明显差异
[33]，由此可知，
TS
1和
TS
2可能在茶氨酸合成过程中具有不同的作用。

谷氨酰胺合成酶/谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶合成谷氨酸的途径(GS/GOGAT 途径)是植物中氨同化的主要途径，该途径中谷氨酰胺合成酶(GS，EC 6.3.1.2)首先催化NH
4
+同化成谷氨酰胺
[34]。

高等植物中的GS通常分为2类，位于细胞质中的称为胞液型
GS(GS
1)，位于细胞质体中的称为质体型GS(GS
2)，GS
1主要存在于非光合组织内，为非光合组织GS的主要形式，而GS
2主要存在于叶绿体基质中,为绿色组织的主要GS形式，它们在植物体内的作用是非重叠的
[35]。

现已从茶树中克隆出多个
GS基因，有
GS
1-1、
GS
GS
1;1、
GS
1;2、
CsGS(一种胞液型GS)。

茶树
CsGS基因表达及生物学活性存在明显的组织差异，芽叶中基因表达量及酶活性较高，老叶其次，茎和根最低，该基因表达及催化活力能被镉、盐胁迫诱导 [26]，脱落酸、水杨酸、H
2O
2能提高其在芽叶和幼叶中的转录水平
[27]。

光照条件下，分别添加铵态氮和硝态氮，茶树顶芽中
CsGS的mRNA表达量和酶活性均增加；暗条件下，只有添加铵态氮时， CsGS的mRNA表达量和酶活性才增加，添加硝态氮时表达量无差异，且酶活性下降
[36]。

史成颖等
[33,37]构建茶树幼根cDNA文库获得2条
GS基因的EST序列，分别命名为
GS
1-1和
GS
1-2，随后徐乾
[38]从茶树叶片中克隆得到
GS
GS
1-2的全长序列。

实时荧光定量PCR显示在添加盐酸乙胺的愈伤组织中，初始
3 d，
GS
1-1的表达在处理组中明显上调，
GS
1-2在对照组和处理组中无明显差异；初始12 d内，
GS
1;1在对照组和处理组中的表达都保持增加，并且处理组中的表达水平约是对照组的2倍
[33]。

经
GS
1-1的RNAi载体转化的叶片愈伤组织中，茶氨酸含量与对照组比较下降60%以上，可见
GS
1-1基因在茶氨酸合成过程中十分重要
[39]。

GS
1;2基因进行原核表达后的蛋白具有明显的转氨基的催化能力，相较于细菌本身 GS的催化能力大大增强
[31]。

缺氮条件下，茶树新梢中
GS基因表达增强，
GS基因表达量与叶片氮含量呈负相关
[40]。

谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶(GOGAT，EC 1.4.1.14，又称谷氨酸合酶)，能将GS催化生成的谷氨酰胺催化生成谷氨酸
[34]。

目前对茶树中GOGAT的研究非常少。

王新超等
[41]对茶树GOGAT在根和叶部的活性进行了研究，成熟叶的活性最高，其次是幼叶，根部的活性最低，叶部活性明显高于根部，表明氮素的还原主要在成熟叶片中进行。

茶树
GOGAT基因目前还未获得完整编码区序列，在添加盐酸乙胺的茶树愈伤组织中，
GOGAT表达量明显上调，是对照组的2倍，且与茶氨酸含量增加相一致 [33]。

实时荧光定量PCR显示，茶树新梢中
GOGAT在相对高茶氨酸种质中的表达量显著低于相对低茶氨酸种质中的表达量
[42]，在缺氮条件下
GOGAT表达量上调
[40]。

茶氨酸合成前体谷氨酸的来源有2条途径，除了GS/GOGAT途径外，还有谷氨酸脱氢酶途径。

谷氨酸脱氢酶(GDH，EC 1.4.1.2)催化α-酮戊二酸发生还原氨基化反应，生成谷氨酸。

茶树吸收利用NH
4
+-N存在2种途径：正常供应NH
4
+-N时，茶树对氮素的吸收以GS/GOGAT进行，而在施入高量的NH
4
+-N时，则能活化GDH，成为茶树同化氮素的辅助途径
[9]。

茶树GDH活性能被高浓度的谷氨酸抑制，在含谷氨酸的培养基中培养时，茶树根系中的GDH活性被抑制，当转移至氨培养基培养时又能被重新激活，此外，谷氨酰胺、茶氨酸和丙氨酸可增强其活性
[26]。

添加盐酸乙胺的愈伤组织初始6 d内，
GDH表达量随茶氨酸含量一起增加
[33]。

实时荧光定量PCR检测发现，茶树新梢中
GDH表达量与茶氨酸含量呈正相关
[42]，缺氮条件下
GDH表达显著下降，且
GDH表达量与叶片氮含量呈正相关
[40]。

目前，关于茶氨酸合成途径中相关酶基因水平的研究不多，茶树尚无基因组序列信息，茶氨酸又只在极少数几种植物中才有，茶氨酸合成相关酶基因的研究存在不少困难，也有不少问题待研究。

茶树
TS与
GS基因具有高度的同源性，
TS
1与GS
1;1同源性高达97%
[33]，
GS
1-2与安吉白茶的茶氨酸合成酶核苷酸序列的相似性为99%
[38]。

茶树
TS
1和GS经原核表达后直接进行酶促反应，TS
1可以催化谷氨酰胺与乙胺合成茶氨酸，而不能催化谷氨酸与盐酸乙胺合成茶氨酸，也不具备GS的催化活力，GS则不能催化谷氨酰胺和谷氨酸合成茶氨酸，可见茶树TS与GS基因虽然同源性很高，蛋白结构也很相似，但是蛋白结合位点与催化反应方式之间存在根本差异
[31]。

茶氨酸合成酶是否为茶树中特有的催化茶氨酸生物合成的一种酶？ TS与
GS之间的关系是怎样的？
TS
1和TS
2存在组织表达差异，且茶氨酸含量增加时，TS
2表达量增加与茶氨酸含量增加相一致，而TS
1表达量无明显差异
[33]，
TS
1和TS
2在茶树茶氨酸合成过程中各自具有什么的作用？
目前，不同研究者对茶树
GS基因与茶氨酸含量之间关系的研究结果尚不一致。

林郑和等
[42]研究报道：茶树新梢中
GS基因mRNA表达量与茶氨酸含量呈负相关。

而史成颖等研究结果显示：茶树愈伤组织中茶氨酸含量增加时，
GS基因mRNA表达量相应增加
[33]。

对茶树
GS基因进行RNA干扰后，茶氨酸含量明显下降
[39]。

目前的研究表明，植物中
GS
1、GS
2作用不同，GS
2主要参与同化NH
4
+，而
GS
1主要参与氮素的再转移，GS基因在同一组织或器官的不同生育阶段表达亦不尽
相同，GS基因的表达调控在转录水平和翻译水平均有，转录水平的调控并不能决定酶活性
[43]。

茶树
GS的相关研究中，有些研究对象不能确定是质体型还是胞液型，或者两
者皆有，所用组织也不同，组织所处的生育阶段也有可能不同，这或许导致了这些研究结果不一致。

茶树
GS有多个转录本，且存在表达差异，它们在茶树体内是否具有不同的作
用，其表达调控模式又是怎样的？
茶树茶氨酸合成相关酶基因的研究尚处于起步阶段，以上这些问题都需要进一步研究。

植物次生代谢过程中，转录因子对基因的调控作用在次生代谢产物合成中起着重要的作用。

茶树茶氨酸合成相关酶基因的研究还未涉及到转录因子的调控作用，这也是未来的研究方向之一。

[1] Casimir J, Jadot J, Renard M. Separation and characterisation of N-ethyl-Glutamine in
Xerocomus
badius (
Boletusladius)[J]. Biochem Biophys Acta, 1960, 39: 462-468.
[3] Li J, Li P, Liu F. Production of theanine by
Xerocomus
badius (mushroom) using submerged fermentation[J]. Lwt-
Food Sci Technol, 2008, 41(5): 883-889.
[4] 宛晓春.茶叶生物化学(3版)[M].北京:中国农业出版社,2003.
[5] Ekborg-
Ott K H, Taylor A, Armstrong D W. Varietal differences in the total and ena ntiomeric composition of theanine in tea[J]. J Agric Food Chem, 1997, 45(2) : 353-363.
[6] Nakagawa M. Chemical components and taste of green tea[J]. Jpn Agric Res Q, 1975, 9(3): 156-160.
[7] 刘媛,王健.茶氨酸的最新研究进展[J].中国食物与营养,2007(10):23-25.
[8] Konishi S, Matsuda T, Takahashi E. Synthesis of theanine and l-glutamic acid γ-methylamide in
Thea
sinensis,
Camellia
sasanqua, and
Oryza
sativa Ⅴ. Metabolism and regulation of theanine and related compounds i n the tea plant[J]. Nippon Dojo-Hiryogaku Zasshi, 1969, 40(3): 107-112.
[9] 竹尾忠一.茶の滋味に関与するテアニンを中心とした茶樹の窒素代謝[J].茶業試験場研究報告,1981,17:1-68.
[10] Selvendran R R, Selvendran S. Distribution of some nitrogenous consti tuents in the tea plant[J].J Sci Food Agric, 1973, 24(2): 161-166.
[11] Sasaoka K, Kito M, Onishi Y. Some properties of the theanine synthesiz ing enzyme in tea seedlings[J]. Agric Biol Chem, 1965, 29: 984-988. [12] Takeo T. L-Alanine as a precursor of ethylamine in
Camellia
sinensis[J]. Phytochemistry, 1974, 13(8): 1401-1406.
[13] Takeo T. L-Alanine decarboxylase in
Camellia
sinensis[J]. Phytochemistry, 1978, 12(2): 313-314.
[14] Wickremasinghe R L, Perera K P W C. Site of biosynthesis and transloc ation of theanine in the tea plant[J]. Tea Quart, 1972, 43: 175-179. [15] Konishi S, Takahashi E. Metabolism of theanine-N-ethyl-
14C and its metabolic redistribution in the tea plant Ⅵ. Metabolism and re gulation of theanine and related compounds in the tea plant[J]. Nippon Do jo-Hiryogaku Zasshi, 1969, 40(11): 479-484.
[16] Oh K, Kato T, XU H L. Transport of nitrogen assimilation in xylem vesse ls of green tea plants fed with NH
4-N and NO
3-N[J].Pedosphere, 2008, 18(2): 222-226.
[17] Takeo T. Ammonium-
type nitrogen assimilation in tea plants[J]. Agric Biol Chem, 1980, 44(9): 20 07-2012.
[18] Konishi S, Yamaji R. Metabolism of theanine, glutamine, and asparagin
e in tea shoots[J]. Nippon Dojo-Hiryogaku Zasshi, 1982, 53(3): 241-246.
[19] Takeo T. Formation of amino acids induced by ammonia application a nd seasonal level fluctuation of amino acids contents in tea plant[J]. Chagy o Gijutsu Kenkyu, 1979, 56: 70-77.
[20] Konishi S, Kasai Z. Metabolism and regulation of theanine and related
compounds in tea plants Ⅱ. Synthesis of theanine from carbondioxide-
14C in tea plants and sites of thesynthesis[J]. Nippon Dojo-Hiryogaku Zasshi, 1968, 39(9): 439-443.
[21] Popov V R. Determination of theanine and free amino acids during de velopment of tea shoots and their technological treatment[J]. Biokhim Pro gr Tekhnol ChaiProizvod, Akad Nauk SSSR, Inst-Biokhim, 1966: 110-115.
[22] Sasaoka K, Kito M, Inagaki H. Studies on the biosynthesis of theanine i n tea seedlings: synthesis of theanine by the homogenate of tea seedlings[ J]. Agric Biol Chem, 1963, 27: 467-468.
[23] Tsushida T, Takeo T. An enzyme hydrolyzing L-
theanine in tea leaves[J]. Agric Biol Chem, 1985, 49(10): 2913-2917. [24] Wickremasinghe R L, Perera B P M, De Silva U L L. Quality and flavor of tea Ⅳ. Biosynthesis of volatile compounds[J]. Tea Quart, 1969, 40(1): 26-30.
[25] Takeo T. Glutamate dehydrogenase from tea rootlet[J]. Agric Biol Che m, 1979, 43(11): 2257-2263.
[26] Rana N K, Mohanpuria P, Yadav S K. Expression of tea cytosolic glutam ine synthetase is tissue specific and induced by cadmium and salt stress[J]. Biologia Plantarum, 2008, 52(2): 361-364.
[27] Rana N K, Mohanpuria P, Yadav S K. Cloning and characterization of a cytosolic ghtamine synthetase from
Camellia
sinensis (L.) O. Kuntze that is upregulated by ABA, SA, and H
2O
2[J]. Mol Biotechnol, 2008, 39(1): 49-56.
[28] Deng W W, Ogita S, Ashihara H. Ethylamine content and theanine bios ynthesis in different organs of
Camellia
sinensis seedlings[J]. Z Naturforsch, 2009, 64C: 387-390.
[29] Deng W W, Ogita S, Ashihara H. Biosynthesis of theanine ([gamma]-ethylamino-L-glutamic acid) in seedlings of
Camellia
sinensis[J]. Phytochem Lett, 2008, 1(2): 115-119.
[30] 李娟,邓婷婷,吴扬,等.茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析[J].茶叶科学,2011,31(5):411-418.
[31] 陈琪.茶树体内茶氨酸合成酶的克隆与异源表达及一氧化氮信号对其调控的研究[D].合肥：安徽农业大学,2011:48-81.
[32] Deng W W, Wang S, Chen Q, et al. Effect of salt treatment on theanine biosynthesis in
Camellia
sinensis seedlings[J]. Plant Physiol Biochem, 2012, 56: 35-40.
[33] 史成颖.茶树幼根EST文库构建及茶氨酸代谢相关基因表达分析[D].合肥：安徽农业大学，2011:79-83.
[34] Lam H M, Coschigano K T, Oliveira I C, et al. The molecular-genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants[J]. Annu Rev Plant Phys, 1996, 47: 569-593.
[35] Edwards J W, Walker E L, Coruzzi G M. Cell-
specific expression in transgenic plants reveals nonoverlapping roles for ch loroplast and cytosolic glutamine synthetase[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 19 90, 87: 3459-3463.
[36] Rana N K, Mohanpuria P, Kumar V. A
CsGS is regulated at transcriptional level during developmental stages and nitrogen utilization in
Camellia
sinensis (L.) O. Kuntze[J]. Mol Biol Rep, 2010, 37(2): 703-710.
[37] 史成颖,宛晓春,江昌俊,等.茶苗嫩根cDNA文库的构建和EST分析[J].南京农业大学学报,2009,32(1):126-131.
[38] 徐乾.茶树中与茶氨酸合成相关的3个基因的克隆与分析[D].合肥：安徽农业大学，2012:20-27.
[39] 汤志近.茶氨酸合成相关基因RNAi载体的构建及茶树遗传转化研究[D].合肥：安徽农业大学，2013:34-35.
[40] 林郑和,钟秋生,陈常颂,等.不同氮浓度下茶树氮合成关键酶基因的表达分析[J].核农学报,2014,28(6):985-989.
[41] 王新超,杨亚军,陈亮.茶树谷氨酸合酶的提取与活性测定[J].中国茶
叶,2004(5):10-11.
[42] 林郑和，钟秋生，陈常颂.茶树叶片
GDH、
GS、
GOGAT基因的克隆及荧光定量PCR分析[J].茶叶科学,2012,32(6):523-529.
[43] 黄冰艳,高伟,苗利娟,等.谷氨酰胺合成酶基因研究进展及其在植物氮代谢调控中的应用[J].中国农学通报,2010,26(23):53-57.。