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交联剂两端具有相同的反应活性部分。如双亚 氨酯，可与氨基反应。两端间的间隔基团是 (CH2)n, n=1~6, 跨度为0.5~1.1nm.
所有同型双功能试剂都对-NH2有专一性, 但戊 二醛例外,它对-NH2和-OH作用, 反应机理不清. ➢ 2.异型双功能试剂:
一端与-NH2作用,另一端通常与-SH侧链作用.但 碳二亚胺的第二反应基团是-COOH.
H
H
OH
OH
2P-NH2 + O=C-(CH2)3-C=O
P-NH-CH-(CH2)3-CH-NH-P
3.3 交联剂的应用
• 研究蛋白质的折叠:
当蛋白质浓度很大时, 交联剂也能形成分子间的 交联键, 使蛋白质对变性趋于稳定。
如Rajput等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶交 联在一起。这种固定化的杂化酶的优点是，显著地 降低了杂化酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反 应器的体积大大缩小。
3+蛋白质的化学修饰
人的差异在于业余时间
蛋白质的化学修饰
主要内容
• 化学修饰的原理 • 蛋白质侧链的修饰 • 蛋白质肽链的交联 • 蛋白质的位点专一性修饰 • 化学修饰结果的解释 • 蛋白质化学修饰的应用 • 蛋白质化学修饰的局限性
3.2 交联剂的类型
• 根据功能基团是否相同分为： ➢ 1.同型双功能试剂：
3.2 交联剂的类型
• 根据交联剂可否被切断或裂解分:
➢ 可裂解交联剂: 将两条多肽链交联后,可以再经 还原剂(如DTT)等将交联的有关化学键切断。 此 类试剂有一个可切断的化学键如酰胺键、酯键 或二硫键等。
此类试剂可用于寡聚酶蛋白质分子中相邻亚 基之间的空间排列和聚合状态，寻找和分离多 肽激素的受体，以及膜蛋白的研究。
2P-XH YH
DTT
Y~~~S-S~~~Y
P-X~~~S-S~~~X-P 2P-X~~~SH
3.2 交联剂的类型
• 不可裂解交联剂:
其与蛋白质交联后, 形成比较稳定的交联桥, 可以增强酶蛋白与载体之间的稳定性, 在一般情 况下是不可切断的。
典型的例子是戊二醛, 它具有两个反应活泼的 醛基, 可与蛋白质分子中的Lys--NH2发生作用, 从 而形成交联. 常被用于酶和蛋白质固定化。
• 非末端-COOH也能产生环化亚酰胺或-天冬氨酸肽键。 • 在蛋白质化学中不占优势地位, 如汞盐常用于修饰-SH, 但
它也能断裂-S-S-键。
主要内容
• 化学修饰的原理 • 蛋白质侧链的修饰 • 蛋白质肽链的交联 • 蛋白质的位点专一性修饰 • 化学修饰结果的解释 • 蛋白质化学修饰的应用 • 蛋白质化学修饰的局限性
酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性， 防止酶失活。因此，设法增加酶分子表面交联键的 数目是酶固定化的方法之一。
3.3 交联剂的应用
• 测定蛋白质亚基的量:
如用辛二亚氨酸二甲酯作用于齐聚体蛋白质, 使 在同一亚基内和多亚基间的Lys残基之间形成交联, 再进行SDS-PAGE, 则可测定其分子量和亚基的数目, 以阐明亚基的组合情况(如单体、二聚体还是三聚体 等）。
3.2 交联剂的类型
➢ 3. 可被光活化试剂:
此类试剂是异型双功能试剂的扩展, 其一端一般含有能与-NH2 或-SH反应的基团, 而另一端则含有对光敏感的基团。也可作成 具有不同跨度或具有可裂解性的试剂。用途广泛。
当交联剂一端反应基团与蛋白质作用后, 经光照, 另一端则产 生一个反应活性部分, 这部分既可是碳烯(来自重氮试剂), 或氮 烯(来自叠氮试剂)。二者为自由基, 有高反应性, 但没有专一性。
5.4 未发现的修饰
• 咪唑基、-SH2、-COOH甚至苯酚的酰化产物在反应条件下 不稳定或在以后的纯化过程中被水解，因而检测不出。这 种暂时性的修饰对构象的影响无疑会改变其它功能基的反 应性和可接近性。
• C端的-COOH能与一定强度的酰化剂作用，暂时形成混合 酸酐, 结果使羧肽酶不能除去C端残基。
四、 蛋白质的位点专一性修饰
• 蛋白质化学修饰试剂的专一性包括：
➢ 1. 试剂对被修饰的基团的专一性：如DTNB只与 蛋白质分子中的Cys-SH发生作用，而不与其它 任何基团发生作用；
➢ 2. 试剂对蛋白质分子中被修饰部位的专一性： 如修饰剂只作用于酶的活性部位，或酶蛋白上 的激素结合部位(受体)等位点.
五、化学修饰结果的解释
➢ 如果修饰发生在活性部位或必需基团上，则蛋 白质活性的丧失与修饰程度一定成某种化学计 量关系，且底物(或与活性部位结合的抑制剂) 必然能降低修饰蛋白的失活程度, 而不与活性部 位结合的分子则无此影响。
➢ 当采用可逆保护试剂时, 修饰失活的蛋白质随保 护基的去除可重新恢复活力, 且活力恢复程度应 与保护基去除量成一定比例关系。
➢ ⑤亲和标记:如胰蛋白酶底物对甲苯磺酰-L-Lys甲酯 (TLME)的抑制剂对甲苯磺酰-L-Lys氯甲酮(TLCK)。
➢ ⑥差别标记：底物或抑制剂保护的活性部位基团被 放射性同位素标记。
➢ ⑦利用蛋白质状态的差异：有时在结晶状态下，可 提高修饰的专一性。
五、化学修饰结果的解释
在确证试剂已经作用于蛋白质的基础上， 用物化方法验证修饰蛋白质在溶液中的构象是 否发生显著变化外, 还应进一步证明修饰作用是 否发生在活性部位上。
• 这类专一性化学修饰称为亲和标记或专一性的 不可逆抑制作用.
主要内容
• 化学修饰的原理 • 蛋白质侧链的修饰 • 蛋白质肽链的交联 • 蛋白质的位点专一性修饰 • 化学修饰结果的解释 • 蛋白质化学修饰的应用 • 蛋白质化学修饰的局限性
5.1 修饰反应专一性的控制
➢ ④利用某些产物的不稳定性：在高pH下，用氰酸、 CS2、O-甲基异硫脲和亚氨酸等，可将-NH2转变成脲 和胍的衍生物；而与-SH形成的产物迅速分解。
用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如 用跨度为0.37~1.45nm的一系列亚氨酯交联糖原磷酸 化酶b, 再结合SDS-PAGE系统测定出, 在有效交联形成
的四聚体上的两Lys残基间距离约为0.8nm。
主要内容
• 化学修饰的原理 • 蛋白质侧链的修饰 • 蛋白质肽链的交联 • 蛋白质的位点专一性修饰 • 化学修饰结果的解释 • 蛋白质化学修饰的应用 • 蛋白质化学修饰的局限性
所有同型双功能试剂都对-NH2有专一性, 但戊 二醛例外,它对-NH2和-OH作用, 反应机理不清. ➢ 2.异型双功能试剂:
一端与-NH2作用,另一端通常与-SH侧链作用.但 碳二亚胺的第二反应基团是-COOH.
H
H
OH
OH
2P-NH2 + O=C-(CH2)3-C=O
P-NH-CH-(CH2)3-CH-NH-P
3.3 交联剂的应用
• 研究蛋白质的折叠:
当蛋白质浓度很大时, 交联剂也能形成分子间的 交联键, 使蛋白质对变性趋于稳定。
如Rajput等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶交 联在一起。这种固定化的杂化酶的优点是，显著地 降低了杂化酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反 应器的体积大大缩小。
3+蛋白质的化学修饰
人的差异在于业余时间
蛋白质的化学修饰
主要内容
• 化学修饰的原理 • 蛋白质侧链的修饰 • 蛋白质肽链的交联 • 蛋白质的位点专一性修饰 • 化学修饰结果的解释 • 蛋白质化学修饰的应用 • 蛋白质化学修饰的局限性
3.2 交联剂的类型
• 根据功能基团是否相同分为： ➢ 1.同型双功能试剂：
3.2 交联剂的类型
• 根据交联剂可否被切断或裂解分:
➢ 可裂解交联剂: 将两条多肽链交联后,可以再经 还原剂(如DTT)等将交联的有关化学键切断。 此 类试剂有一个可切断的化学键如酰胺键、酯键 或二硫键等。
此类试剂可用于寡聚酶蛋白质分子中相邻亚 基之间的空间排列和聚合状态，寻找和分离多 肽激素的受体，以及膜蛋白的研究。
2P-XH YH
DTT
Y~~~S-S~~~Y
P-X~~~S-S~~~X-P 2P-X~~~SH
3.2 交联剂的类型
• 不可裂解交联剂:
其与蛋白质交联后, 形成比较稳定的交联桥, 可以增强酶蛋白与载体之间的稳定性, 在一般情 况下是不可切断的。
典型的例子是戊二醛, 它具有两个反应活泼的 醛基, 可与蛋白质分子中的Lys--NH2发生作用, 从 而形成交联. 常被用于酶和蛋白质固定化。
• 非末端-COOH也能产生环化亚酰胺或-天冬氨酸肽键。 • 在蛋白质化学中不占优势地位, 如汞盐常用于修饰-SH, 但
它也能断裂-S-S-键。
主要内容
• 化学修饰的原理 • 蛋白质侧链的修饰 • 蛋白质肽链的交联 • 蛋白质的位点专一性修饰 • 化学修饰结果的解释 • 蛋白质化学修饰的应用 • 蛋白质化学修饰的局限性
酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性， 防止酶失活。因此，设法增加酶分子表面交联键的 数目是酶固定化的方法之一。
3.3 交联剂的应用
• 测定蛋白质亚基的量:
如用辛二亚氨酸二甲酯作用于齐聚体蛋白质, 使 在同一亚基内和多亚基间的Lys残基之间形成交联, 再进行SDS-PAGE, 则可测定其分子量和亚基的数目, 以阐明亚基的组合情况(如单体、二聚体还是三聚体 等）。
3.2 交联剂的类型
➢ 3. 可被光活化试剂:
此类试剂是异型双功能试剂的扩展, 其一端一般含有能与-NH2 或-SH反应的基团, 而另一端则含有对光敏感的基团。也可作成 具有不同跨度或具有可裂解性的试剂。用途广泛。
当交联剂一端反应基团与蛋白质作用后, 经光照, 另一端则产 生一个反应活性部分, 这部分既可是碳烯(来自重氮试剂), 或氮 烯(来自叠氮试剂)。二者为自由基, 有高反应性, 但没有专一性。
5.4 未发现的修饰
• 咪唑基、-SH2、-COOH甚至苯酚的酰化产物在反应条件下 不稳定或在以后的纯化过程中被水解，因而检测不出。这 种暂时性的修饰对构象的影响无疑会改变其它功能基的反 应性和可接近性。
• C端的-COOH能与一定强度的酰化剂作用，暂时形成混合 酸酐, 结果使羧肽酶不能除去C端残基。
四、 蛋白质的位点专一性修饰
• 蛋白质化学修饰试剂的专一性包括：
➢ 1. 试剂对被修饰的基团的专一性：如DTNB只与 蛋白质分子中的Cys-SH发生作用，而不与其它 任何基团发生作用；
➢ 2. 试剂对蛋白质分子中被修饰部位的专一性： 如修饰剂只作用于酶的活性部位，或酶蛋白上 的激素结合部位(受体)等位点.
五、化学修饰结果的解释
➢ 如果修饰发生在活性部位或必需基团上，则蛋 白质活性的丧失与修饰程度一定成某种化学计 量关系，且底物(或与活性部位结合的抑制剂) 必然能降低修饰蛋白的失活程度, 而不与活性部 位结合的分子则无此影响。
➢ 当采用可逆保护试剂时, 修饰失活的蛋白质随保 护基的去除可重新恢复活力, 且活力恢复程度应 与保护基去除量成一定比例关系。
➢ ⑤亲和标记:如胰蛋白酶底物对甲苯磺酰-L-Lys甲酯 (TLME)的抑制剂对甲苯磺酰-L-Lys氯甲酮(TLCK)。
➢ ⑥差别标记：底物或抑制剂保护的活性部位基团被 放射性同位素标记。
➢ ⑦利用蛋白质状态的差异：有时在结晶状态下，可 提高修饰的专一性。
五、化学修饰结果的解释
在确证试剂已经作用于蛋白质的基础上， 用物化方法验证修饰蛋白质在溶液中的构象是 否发生显著变化外, 还应进一步证明修饰作用是 否发生在活性部位上。
• 这类专一性化学修饰称为亲和标记或专一性的 不可逆抑制作用.
主要内容
• 化学修饰的原理 • 蛋白质侧链的修饰 • 蛋白质肽链的交联 • 蛋白质的位点专一性修饰 • 化学修饰结果的解释 • 蛋白质化学修饰的应用 • 蛋白质化学修饰的局限性
5.1 修饰反应专一性的控制
➢ ④利用某些产物的不稳定性：在高pH下，用氰酸、 CS2、O-甲基异硫脲和亚氨酸等，可将-NH2转变成脲 和胍的衍生物；而与-SH形成的产物迅速分解。
用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如 用跨度为0.37~1.45nm的一系列亚氨酯交联糖原磷酸 化酶b, 再结合SDS-PAGE系统测定出, 在有效交联形成
的四聚体上的两Lys残基间距离约为0.8nm。
主要内容
• 化学修饰的原理 • 蛋白质侧链的修饰 • 蛋白质肽链的交联 • 蛋白质的位点专一性修饰 • 化学修饰结果的解释 • 蛋白质化学修饰的应用 • 蛋白质化学修饰的局限性