一株降解玉米秸秆菌株的分离、鉴定及其降解能力的研究

一株降解玉米秸秆菌株的分离、鉴定及其降解能力的研究周沅洁;马桂英;王修俊;艾静汶;朱隆绘
【摘要】从玉米秸秆上分离筛选出的S-3菌株能够分泌纤维素酶,具有降解农作物秸秆的能力.该菌经鉴定为芽孢杆菌属,其产纤维素酶活为172.786 U/g,最佳降解条件为发酵时间11d、发酵温度32℃、料水比1:2.5、S-3菌株用量10 mL.在上述条件下,纤维素占发酵干基的比率从最初的35.48％降到23.26％;木质素从最初的15.37％降到14.51％.
【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2012(039)020
【总页数】4页(P87-90)
【关键词】秸秆;分离筛选;鉴定;降解能力
【作者】周沅洁;马桂英;王修俊;艾静汶;朱隆绘
【作者单位】贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳550025;贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳550025;贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳550025;贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳550025;贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳550025
【正文语种】中文
【中图分类】S182
我国秸秆年产量达5.7×108t，占世界秸秆总产量的20%～30%，是生物质能源的重要组成部分[1-2]。

目前我国对秸秆的主要处置方式是无控焚烧，在这个过程中
对环境产生了不容忽视的污染[3]。

秸秆的合理利用已引起了人们的广泛关注，已
成为农业可持续发展的重要组成部分[4]。

因秸秆的细胞壁中含有大量的木质素、
纤维素和半纤维素[5-6]，造成了秸秆降解困难。

本研究从长有菌落的玉米秸秆上
分离、筛选出的S-3菌株具有降解农作物秸秆的能力，对该菌株产生的纤维素酶
活力进行测定[7-11]，并对其降解玉米秸秆条件进行优化，为秸秆的合理利用研究奠定基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料
玉米秸秆：采自贵阳市郊农田。

培养基：PDA培养基（富集培养基），查氏培养基（纯化培养基），初筛培养基（磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲溶液500 mL，CMC-Na 7.5 g，琼脂 7.5 g）。

DNS：准确称量6.3 g 3,5-二硝基水杨酸与262 mL 2 mol/L NaOH溶液混合，
并加入到500 mL含182 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g苯酚和5 g亚硝
酸钠，搅拌溶解，冷却定容至1 000 mL。

避光保存1周后使用。

1.2 菌种分离、鉴定
1.2.1 菌种分离（1）富集培养：把秸秆放在湿润的土堆里，并置于30℃的恒温培养箱中培养，直至长出菌落，然后放入盛有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，用漩涡混合器混合30 min，涂布接种到PDA平板培养基中，在30℃的恒温培养箱中培养。

（2）纯化培养：经富集后，接种在查氏培养基上涂布分离，并在30℃的培养箱
中培养3 d，纯化至单菌落。

（3）初筛培养：将单菌落接种到初筛培养基中，每
株3个平行，在30℃的培养箱中培养3 d。

（4）染色：0.2%刚果红染色30 min，
蒸馏水、1 mol/L NaCl洗去染色，5%醋酸液固定颜色5 min。

1.2.2 菌种鉴定（1）参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[13]进行初步鉴定。

（2）16SrDNA序列测定。

按照生工SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书对S-3菌株进行基因DNA提取纯化及
16SrDNA序列分析。

正向引物序列为7F:5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'、反向引物序列为540R:5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR反应总体积为25 μL：2.5 μL 10×PCR Duffer、0.5 μL 10 mmol/L dNTP、0.5 μL 10 μmol/L 前引物、末端引物、0.2 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶、1 μL DNA 模板，补足无菌去离子
水至25 μL。

PCR 反应扩增程序：94℃预变性 5 mim；94℃变性 30 s、55℃复
性 35 s、72℃延伸 1 min，35 个循环反应；72℃延伸 8 min。

1.3 菌株S-3产纤维素酶能力的测定
1.3.1 葡萄糖标准曲线（1）1 mg/mL标准葡萄糖溶液的配制。

精确称取于105℃下干燥2 h的分析纯葡萄糖0.5000 g加蒸馏水溶解，稀释定容至500 mL。

（2）葡萄糖标准浓度曲线的绘制。

分别取1 mg/mL标准葡萄糖液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于不同编号的 25 mL容量瓶中，加去离子水补足至2 mL，再分别添加DNS试剂2 mL。

在沸水浴中反应10 min，冷却后定容至25 mL，在λ=520 nm下，用722S分光光度计测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 菌株产纤维素酶的活力测定（1）酶液的制备：将分离出的菌落接入到100 mL无菌水中，震荡，摇匀，然后各吸取15 mL菌悬液接种到液体初筛培养基中，30℃下以120 r/min摇床培养。

从发酵培养液中分别提取20 mL种子液，加入离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

（2）酶活力的测定：取1.8 mL，0.5%pH5.0的羧甲基纤维素钠-柠檬酸缓冲液于25 mL具塞刻度试管中，在55℃的恒温水浴锅中预热10 min，加入0.2 mL稀释100倍的酶液，55℃水浴
30 min，加入1.5 mL DNS，混匀，放在沸水中煮沸10 min后冷却，定容至25 mL，520 nm下测定吸光度，空白取2 mL pH 5.0的柠檬酸缓冲液于25 mL具塞刻度试管中。

对在55℃、pH5.0的条件下每分钟催化水解底物生成1 μmol葡萄
糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）[14]，计算出该酶的活力。

1.4 菌株S-3降解玉米秸秆条件的优化
1.4.1 培养基 S-3菌株种子培养液的制备：将PDA液体培养基灭菌，装于三角瓶中，接种，30℃下恒温恒湿培养3 d，即为S-3菌株种子培养液。

发酵培养基：
将5 g玉米秸秆粉、5g酱油渣装于250 mL的三角瓶中，加一定量的水搅拌均匀，灭菌冷却后，接入一定量的的S-3菌种子液，在一定的温度下培养一定时间，测
定纤维素和木质素含量。

通过发酵时间、发酵温度、料水比、接种量等条件的优化，得到菌株S-3降解玉米秸秆的最佳条件。

1.4.2 木质素和纤维素分析（1）将经80℃、3 h烘干至衡重的玉米秸秆粉粹过630 μm筛后各取1.0000 g样品置于100 mL碘瓶中，设3组平行，加入70 mL 中性洗涤剂，放入已沸的高压锅，100℃保温40 min，115～121℃保温20 min，取出用3号30 mL砂芯坩埚过滤至pH值6.5～7.0，依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2次，将残渣置真空干燥器中，干燥20 min。

（2）将残渣连同坩埚
置于100 mL烧杯中，加入70 mL 2 mol/L盐酸溶液，放入已沸的高压锅，100℃保温50 min，过滤至中性，依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2次，残渣80℃烘干至衡重为W1。

（3）将残渣连同坩埚置于150 mL烧杯中，加入10 mL 致冷的72%硫酸，20℃降解4 h后加入90 mL蒸馏水，室温过夜，次日用蒸馏水洗残渣至pH值6.5，烘干至衡重为W2，W1-W2为纤维素的含量。

（4）将残渣在550℃马福炉中灰化，干燥器中平衡至衡重为W3，W2-W3即为木质素的含量。

2 结果与分析
2.1 菌株S-3的分离、纯化
在纯化培养基上，把富集得到的菌株通过多次划线分离出单菌落，染色鉴定出1
株能分泌纤维素酶的菌株（图1），命名为S-3。

从图1菌落的形态可以看出，菌落不透明，表面较为光滑、湿润，初步鉴定为细菌范畴中的厚壁菌纲芽孢杆菌属[12-13]。

图1 S-3菌种鉴定平板
2.2 16SrDNA序列测定
对S-3菌株进行基因DNA提取纯化及16SrDNA序列分析，电泳图谱见图2，DNA序列见图3。

从图2可以看出，约在1 200～1 500 bp处出现了明显的荧光条带，说明PCR扩增成功，能满足后续的测序需要。

由图3可知，菌株S-3属于细菌范畴，为厚壁菌纲–芽孢杆菌目–芽孢杆菌科–芽孢杆菌属。

S-3菌株与几株标
准菌株的相似性比较见表1，比对结果表明S-3菌株属于芽孢杆菌属的亚种。

图2 PCR产物电泳图谱
2.3 菌株S-3产纤维素酶能力的测定
绘制葡萄糖标准曲线如图4。

试验得出的吸光度为0.307，由校准标准曲线查得葡萄糖浓度为0.010 mg/mL，根据酶活力计算公式得S-3菌株纤维素酶活力
172.786 U/g。

2.4 菌株S-3降解玉米秸秆条件的优化
发酵时间：在加水量30 mL，接种量4 mL，30℃条件下培养 5、8、11、14、17、21 d 后，测定纤维素和木质素含量，结果表明最佳降解时间为11 d。

图3 S-3菌株测序结果
表1 S-3与几株标准菌株的相似性比较序列号AY905693 DQ005496 DQ012095 EF433407 EF471916 CP000560 FJ393326 EU308310 EU308311 FJ685773种名Bacillus subtilis subsp.subtilis Bacillus subtilis subsp.subtilis Bacillus subtilis subsp.subtilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus sp.Bacillus
amyloliquefaciens Bacillus sp.Bacillus sp.Bacillus sp.Bacillus amyloliquefaciens菌种号CICC10265 CICC10163 CICC10160 BCRC17467
M1-20 FZB42 MSJ-5 SA04_1 SA04_2 PEBA0801相似性（%）99.5 99.5 99.5 99.5 99.5 99.5 99.5 99.5 99.5 99.5
图4 葡萄糖标准曲线
发酵温度：在加水量30 mL、接种量4 mL的条件下，分别以 26、28、30、32、34、36℃条件培养 11 d 后，测定纤维素和木质素含量，结果表明最佳发酵温度
为32℃。

料水比：在接种量4 mL，料水比分别为1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4，32℃条件下培养 11 d 后，测定纤维素和木质素含量，结果表明最佳料水比为1∶2.5。

接种量：在料水比为1∶2.5，发酵温度32℃，接种量分别为 2、4、6、8、10、12 mL 的条件下培养 11 d，测定纤维素和木质素含量，结果表明最佳接种量为
10 mL。

以上述最优条件进行发酵，测定玉米秸秆中纤维素、木质素的降解情况。

经发酵后，纤维素占发酵干基的比率从最初的35.48%降为23.26%，木质素占发酵基质的比
率从最初的15.37%降为14.51%。

3 结语
从玉米秸秆上分离出的S-3菌株，从菌落形态上看，表面光滑，在CMC-Na-刚果红鉴定培养基上可以看到有透明圈，对S-3菌株进行基因DNA的提取纯化及
16SrDNA序列分析，经过比对S-3菌株属于芽孢杆菌属的亚种。

S-3菌株分泌纤维素酶，经测定纤维素酶活为172.786 U/g，表明该菌具有降解纤维素的能力。

通过单因素试验对菌株S-3降解玉米秸秆的条件进行优化，试验结果的最佳发酵
条件为：发酵时间11 d、发酵温度32℃、料水比1∶2.5、S-3菌株用量10 mL。

在此条件下纤维素占发酵干基的比率从最初的35.48%降为23.26%，木质素占发酵基质的比率从最初的15.37%降为14.51%。

参考文献：
[1]贾昕宇,王宏立,张吉军.农作物秸秆资源的开发与利用[J].农机化研
究,2007(7):217-219.
[2]汪海波,章瑞春.中国农作物秸秆资源分布特点与开发策略[J].山东省农业管理干
部学院学报,2007,23(2):164-165.
[3]曹稳根,高贵珍,方雪梅,等.我国农作物秸秆资源及其利用现状[J].宿州学院
报,2007,22(6):110-112.
[4]张文斌,张龙全.秸秆气化技术研究现状与对策分析[J].中国农机化,2009(6):90-93.
[5]董文.秸秆的微生物降解研究现状[J].科技信息,2007(5):13.
[6]马桂英,王修俊,曲源,等.农作物秸秆资源的基本现状及其研究[J].科技成果管理与研究,2011,61(11)59-60,68.
[7]熊素敏,左秀凤,朱永义.稻壳中纤维素、半纤维素和木质素的测定[J].粮食与饲料工业,2005(8):40-41.
[8]苏同福,高玉珍,刘霞,等.木质素的测定方法研究进展[J].河南农业大学学
报,2007,41(3):356-362.
[9]曲源,王修俊,孙倩.发酵和酶解共处理玉米秸秆研究[J].安徽农业科
学,2010,38(19):10484-10485.
[10]王金主,王元秀,李峰,等.玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的测定[J].山东食品发酵,2010,3(158):44-47.
[11]倪启亮,王敦球,戚拓业.木质素降解酶的酶活测定方法探讨[J].广西农学
报,2008,23(2):54-57.
[12]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001.
[13]布坎南RE,吉布斯NE.伯杰氏细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001.
[14]伍时华,徐雅飞,黄翠姬.降解纤维素菌株的筛选[J].食品科技,2006(8):50-52.。