一种低场核磁共振技术快速定量检测发酵液油浓度方法

一种低场核磁共振技术快速定量检测发酵液油浓度方法
张亚飞;王泽建;陈中兵;后慧云;杭海峰;郭美锦
【摘要】The purpose of this paper is to develop a more convenient,rapid and unpretreated method to measure the oil content in the culture medium.A quantitative method for determining the oil content in the fermentation medium using low field NMR(LF-NMR) instruments has been developed.All components of the medium were detected using the LF-NMR technology and the relaxation time of oil is about 100ms using LF-NMR.Except for soybean flour and wheat germ flour,no ingredients had significant effects on the oil peak area in the single-factor experiments.The oil content determined by LF-NMR tests showed that it had a good stability (CV=4.4％) and accuracy of about 1.0％.In addition,the oil contents determined by the method of N-hexane extraction and LF-NMR technology presented a linear relationship with a correlation R2 of
0.9581.The LF-NMR method is more convenient and accurate than the traditional methods of oil detections such as n-hexane
extraction,indicating that LF-NMR method could be applied in the industrial process to monitor the oil content in the broth.%建立了一种方便、快捷和无损的低场核磁共振(LF-NMR)技术检测发酵液中油的方法.通过对培养基中各成分的检测,确定了油脂的弛豫时间约100ms;单因素实验表明除了黄豆粉和胚芽粉造成取样不均对油峰面积有一定的影响,其他成分对油峰面积无明显影响;含油量
不同的梯度实验结果表明了LF-NMR检测油时有良好的稳定性(相对偏差约为
4.4％)和精确性(约1.0％);正己烷萃取法测定油浓度与LF-NMR法测定的油浓度进
行线性相关分析,相关性良好(R2=0.9581).因此,应用LF-NMR检测发酵液中油浓度比传统的检测方法(如正己烷萃取法等)更方便和准确,可应用于工业发酵监控.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2017(042)008
【总页数】7页(P673-679)
【关键词】低场核磁共振技术;白色链霉菌;油脂;横向弛豫
【作者】张亚飞;王泽建;陈中兵;后慧云;杭海峰;郭美锦
【作者单位】华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;上海生物制造技术协同创新中心,上海200237;浙江升华拜克生物技术股份有限公司,湖州313220;上海纽迈电子科技有限公司,上海200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;上海生物制造技术协同创新中心,上海200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;上海生物制造技术协同创新中心,上海200237【正文语种】中文
【中图分类】R978;Q939.97
在抗生素发酵工业生产中，以油为碳源广泛应用。

油作为基质发酵有许多用途，如不易发生碳源分解代谢产物阻遏作用利于合成次级代谢产物、表面张力低不易产生气泡而提高发酵罐的利用率；同时，还有强化氧传递、产物萃取剂、底物增溶剂和代谢激活剂等作用[1]。

目前，油在抗生素发酵工业中的作用还是不可替代的。

为了提高发酵效率，需要对油脂进行定量检测，有效控制发酵过程的进行。

但是，现在油脂的定量检测方法在指导发酵调控的过程中还有很多不足。

索氏提取法[2]等
传统的萃取技术虽然经典，但是有操作繁琐、过程复杂及费时费力等缺点；尼罗红(nile red stain)等染料染色利用分光光度计检测油脂的方法，由于染料本身特性的局限性，具有操作复杂、不安全且误差较大等缺点[3]；色谱质谱联用法(GC-MS)等为代表的色谱技术检测油脂准确性较高，但是对样品处理要求高，检测样品时成本和时间花费较大[4]；近红外光谱法(near infrared)在油脂常规分析发展中起着重要的作用，但其灵敏度差、扫描时间长和样品需要专门处理等缺点在工业生产上应用还不充分[5]。

低场核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)是恒定磁场强度低于0.5T的核磁共振现象[6-7]。

目前，LF-NMR技术以其快速、无损、样品需要量少且处理简单等特点，在食品科学的检测领域表现出了一定的应用潜力。

李潮锐等[8]基于单位质量干燥花生和纯花生油两者的脂肪弛豫谱峰面积之比获得与索氏抽提法相吻合的含油率，Zhu等[9]使用低场核磁共振技术检测了猪长肌中的持水量(water holding capacity, WHC)，宋平等[10]通过核磁共振研究水分状态及变化过程和浸种方法对水稻种子吸水量的影响，王乐等[11]通过核磁共振法鉴别食用植物油掺伪餐饮业废油脂，Sørland等[12]使用低场核磁共振检测肉中脂肪和水含量等。

这些研究仅限于低水溶液的短弛豫体系，相对于高水体系，目前国内外相关研究非常少。

张文叶等[13]运用低场核磁共振技术研究了山楂酒发酵过程中水分的变化规律，刘婷婷等[14]对小球藻进行高温烘干处理，把高水体系转化为低水体系利用低场核磁技术进行油脂的测定，熊婷等[15]建立了含糖量与自旋-自旋弛豫时间关系的数学模型，鲍晨炜[16]应用低场核磁系统识别不同品牌的红茶和绿茶，这些研究只限于定性研究。

低场核磁共振技术能准确检测低水体系中油脂含量，但是发酵培养基中油脂的检测属于高水体系，目前还没有文献报道其定量检测方法。

为此，本文通过对生产盐霉素的白色链霉菌(Streptomyces albus)进行摇瓶发酵培养，采用油脂的横向弛豫
时间检测培养基中油含量，建立了定量检测培养基中油的方法。

该方法具有快速，方便等定量测定特点。

白色链霉菌A30，由浙江升华拜克生物科技有限公司提供。

氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾和碳酸钙均为分析纯，购买于上海凌峰化学试剂有限公司；尿素、酒石酸铵为分子级，购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；黄豆粉和胚芽粉为生化级，大豆油为一级均由浙江升华拜克生物科技有限公司提供。

振荡器和水浴锅购买于上海华连医疗器械有限公司，磁旋搅拌器购买于杭州仪表电机有限公司，低场核磁共振仪(型号：PQ001)由上海纽迈电子科技有限公司制造，其检测原理[17-19]为：核磁共振是指原子核会表现出对射频脉冲能量的强烈吸收，从低能级跃迁到高能级的现象，通常用carr-purcellmeiboom-gill(CPMG)序列方法来测量n个弛豫组分横向弛豫时间(T2n)。

1.3.1 培养基的配制
斜面培养基(g/L)：可溶性淀粉20、牛肉浸1.5、磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、氯化钠0.5、硝酸钾1、硫酸亚铁0.01和琼脂粉18，用浓盐酸调节pH至7.0后用
蒸馏水定容至1L，121℃条件下灭菌25min。

种子培养基(g/L)：黄豆饼粉30、葡萄糖40、酵母粉10和碳酸钙2，用浓盐酸调节pH至7.0，蒸馏水定容至1L，115℃条件下灭菌25min。

发酵培养基(g/L)：胚芽粉8、黄豆粉5、氯化钾2.2、尿素1.6、氯化钠1、酒石
酸铵2、硫酸镁0.1、磷酸氢二钾0.2、碳酸钙5和大豆油150，用浓盐酸调节pH 至7.0，蒸馏水定容至1L，121℃条件下灭菌30min。

1.3.2 白色链霉菌的培养
取出低温保藏的孢子悬浮液，待融化后，在无菌操作台中使用无菌长竹签沾取菌液斜面上划线，将斜面用置于30℃恒温培养箱里面培养5d。

然后，将斜面挖块
(1cm×1cm)接入种子瓶中，在32℃和250r/min条件下培养24h左右，按10%
的接种量接入发酵瓶。

在32℃和250r/min条件下培养10d，第2、4、6、8和
10d取样，进行相关检测。

1.3.3 高水体系培养基的低场核磁共振技术检测方法
量取一定质量的样品，装入试管(21mm×200mm)中，试管中样品的高度不高于
2cm，使用核磁共振分析应用软件Ver 1.0中的CPMG序列检测。

1.3.4 正己烷萃取油的检测方法
取20mL发酵液加入20mL正己烷，振荡均匀，5000r/min离心10min；取上清倒入到干净的平皿(称其质量为W0)中，将剩下的发酵液再次用10mL的正己烷萃取，振荡均匀，5000r/min离心10min；取上层正己烷倒入之前的平皿中。

将培
养皿放置在60℃烘箱中，待正己烷挥发后，取出干燥后的培养皿，称重为W1，
然后计算出发酵液中残油的含量。

发酵液中油含量：
利用T-invfit软件对LF-NMR弛豫检测得到的自由诱导指数衰减曲线进行反演拟合，可得到培养基的多组分弛豫时间(T2)数据图谱。

当将培养基看作一个整体组分分析时，可反演得到培养基的单组分弛豫时间(T2w，单位：ms)。

应用Origin8.0软件对数据进行拟合，应用SPSS19.0软件对获得的数据进行统计分析。

培养基中成分复杂，先分别对培养基中主要成分进行单独检测，探究其响应特性。

选取去离子水、大豆油、黄豆粉和胚芽粉进行LF-NMR检测，结果如图1。

水的
弛豫时间(T2)约为2500ms，油的弛豫时间约为100ms。

黄豆粉和胚芽粉是复合物，主要含有蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸和钙、铁、钾、镁等，不能像纯水和纯油那样确定某种物质的T2，经过反演拟合能够得到一类或几类物质的弛豫时间。

由图1可知，随着物质质量的增加，CPMG响应值随之增大，峰面积也随之增大，同时也影响峰起始时间、峰顶点时间(弛豫时间)、峰结束时间，但对弛豫时间影响较小。

当质量相同的时候，油和水的CPMG响应值远大于黄豆粉和胚芽粉。

黄豆
粉和胚芽粉的反演拟合图中有约4个峰，依次为结合水峰，蛋白质、维生素等峰，脂肪酸、不饱和脂肪酸等峰。

2.2.1 水质量的表征
不同水体积在LF-NMR法下测定的CPMG响应值和相应的油峰面积进行线性相关拟合，结果如图2。

水体积与相应峰面积的相关性(R2=0.9988)大于水体积与相应CPMG响应值的相关性(R2=0.9984)，所以在LF-NMR检测中水峰面积表征水体
积更合适。

2.2.2 油质量的表征
不同质量的油在LF-NMR法下测定的CPMG响应值和相应的峰面积进行线性相关拟合，结果如图3。

油质量与相应峰面积的相关性(R2=0.9442)大于油质量与相应CPMG响应值的相关性(R2=0.9334)，所以在LF-NMR检测中油峰面积表征油质
量更合适。

2.2.3 培养基中油的表征
取相同体积含油量不同的培养基进行LF-NMR检测，油质量与CPMG响应值和相应的峰面积进行线性相关拟合，结果如图4，油质量与相应油峰面积的相关性
(R2=0.9842)远大于油质量与相应CPMG响应值的相关性(R2=0.1883)，所以培
养基在LF-NMR检测中使用油峰面积表示培养基中油的质量更合适。

培养基的成分是复杂的，每种物质都可能对油脂峰的出峰时间、封顶点时间、峰结束时间及峰面积大小等造成影响。

为了确定每种物质是否对油脂峰面积的影响，分别对每种物质进行研究。

以每种组分为变量，设置6个梯度3个平行进行LF-NMR检测，结果如表1。

随着培养基各组分含量的增加，油峰面积并没有随之呈现规律性变化。

通过分析，碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钠、酒石酸铵和尿素的变异系数均小于7%，对油峰面积的影响在误差范围内；而黄豆粉和胚芽粉的变异系数分别为32.2%和19.5%，对培养基中油峰面积有较大的影响。

黄豆粉和胚芽粉是复合物，具有水中不溶和成分复杂的特性，易取样不均可能是造成较大的变异系数的原因。

减小黄豆粉和胚芽粉对油峰面积影响的有效手段是取样时使培养基溶解充分，震荡均匀后迅速取样。

从培养基的配制到LF-NMR检测的整个过程，许多操作都可能造成误差。

尽量减少油脂在LF-NMR检测时的操作步骤是减小误差的有效方法。

2.4.1 大豆油的LF-NMR检测
为了确定LF-NMR对少量油的灵敏度，为此建立了“面积质量比”来表示，面积质量比即每克油对应的峰面积。

随着油质量的增加，面积质量比保持稳定(表2)，说明低场核磁共振仪对油的敏感度与油质量多少无关。

此时油质量与峰面积做线性相关拟合(图5)。

拟合曲线：
式中，Y表示峰面积，X表示油质量，相关性良好，以此式计算培养基中含油量。

2.4.2 培养基中低浓度油的LF-NMR检测
配制含油量不同的培养基进行LF-NMR检测，每个梯度5个平行，每次检测取样2mL，如表3。

含油量低于0.8%的培养基的油峰面积变化较小，可能是培养基中黄豆粉和胚芽粉等物质的影响。

各梯度的相对偏差都在误差范围内，其平均值为4.4%，可知低场核磁仪检测的稳定性良好。

含油量大于0.8%培养基的油峰面积质量比值和纯大豆油的面积质量比值相一致，可知准确性良好。

2.4.3 低浓度油水混合物的LF-NMR检测
配制含油量为0、0.1%、0.2%、0.5%、0.8%和1.0%的油水混合物进行LF-NMR 检测，结果如表4。

油含量达到0.8%以上才能检测到油的存在，油水混合物中油的面积质量比值和纯大豆油的面积质量比值相一致，同时也证明了培养基中其他成分对油峰面积的影响极小。

2.4.4 LF-NMR法准确性验证
通过对已知含油量(1%、3%、5%、8%和10%)的培养基进行正己烷萃取法和低场
核磁共振法检测，结果如表5。

LF-NMR法测得油质量比正己烷萃取法更接近真
实值，其准确性良好。

菌丝体是有机体，发酵液检测时严重影响发酵液中油的检测。

发酵液中菌丝体是随着发酵时间的进行而逐渐增多的，从而导致本应逐渐减小的油峰面积逐渐增大。

对发酵液进行不同方式的处理，找出合理的处理方式，进而对发酵液中的油进行准确检测，结果如表6～8，其中，A～E表示发酵液的不同处理方式：A：代表取发酵液2mL至普通离心管离心，移液枪转移上清至检测玻璃试管；B：取发酵液3mL
至普通离心管离心，移液枪转移上清至检测玻璃试管；C：取发酵液3mL至普通
离心管离心，上清直接倒入检测玻璃试管；D：取发酵液1mL至滤芯离心管离心，移液枪转移上清至检测玻璃试管；E：正己烷萃取。

由表6～7可知，随着发酵时间的进行，CPMG响应值呈现出无规律的变化，油峰面积逐渐递减。

证明了发酵液不经处理直接进行LF-NMR测定，CPMG响应值和油峰面积随发酵时间增大的趋势是菌丝体的影响，又验证了“峰面积表征发酵液中油含量比响应值更合适”。

由方程(2)计算得到每毫升发酵液的含油量和正己烷萃取得到的每毫升发酵液油含量，结果如表8。

把正己烷萃取测得的油质量和用LF-NMR测得的油质量做线性
相关拟合，结果如图6，说明LF-NMR检测可行。

由表8可知，每毫升油含量B
＞A＞E＞D，可知LF-NMR检测油含量的准确性高于传统的油检测方法。

如果发
酵液使用油性滤膜的玻璃滤芯离心管进行离心处理，将大大减少处理过程中的损失，使得结果更加准确。

低场核磁共振技术运用CPMG序列对培养基进行T2时间检测，油脂的弛豫时间
在20～300ms之间。

索氏提取复杂的提取工艺及GC-MS复杂的前处理使其在发酵液中油脂检测的应用较少。

目前，正己烷萃取法是发酵液中油脂检测最常用的方法，但是其萃取物中还
有其他脂溶性物质，准确性和精确性不高；低场核磁共振检测时能够准确区分油脂的弛豫时间和非油脂弛豫时间，准确性和精确性更高。

正己烷萃取需要萃取、离心、挥发、称量、计算等操作，费时较长且正己烷挥发对人体健康有害，而LF-NMR
检测只需简单离心处理就可进行检测得到结果，操作简单快捷且无毒无害。

低场核磁共振技术检测盐霉素发酵液中油脂含量是一种可靠的方法，可以用于盐霉素发酵液中油脂含量的快速检测，将其应用于发酵代谢调控中可以使油脂代谢调控更加简单快捷，进一步可以实现油脂代谢的自动调控。

【相关文献】
[1] 贾士儒. 油脂在抗生素发酵工业中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2001, 21(6): 74-76.
[2] 郑小坚, 张雨青. 昆虫蛹油的索氏提取法[J]. 生物学通报, 2001, 36(1): 36-37.
[3] 林义, 钟添华, 骆祝华, 等. 尼罗红染色法筛选产油酵母及定量检测胞内油脂含量的研究[J]. 微生
物学通报, 2012, 39(1): 125-137.
[4] 李永伟. 环境污染事故中油脂的检测方法[J]. 福建分析测试, 2016, 25(3): 44-47.
[5] 刘娅, 赵国华, 陈宗道, 等. 近红外光谱技术及其在油脂检测中应用[J]. 中外食品加工技术, 2002, 11: 35-37.
[6] Blümich B, Perlo J, Casan ova F. Mobile single-sided NMR[J]. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc, 2008, 52(4): 197-269.
[7] Bank S. Some principles of NMR spectroscopy and their novel application[J]. Concepts Magn Reson, 1997, 9(2): 83-93.
[8] 李潮锐, 刘青, 杨培强. 鲜花生的低场核磁共振横向弛豫分析[J]. 中山大学学报: 自然科学版, 2014, 53(2): 1-5.
[9] Zhu H, O'Farrell M, Bouquet G, et al. Evaluating nuclear magnetic resonance (NMR) as
a robust reference method for online spectroscopic measurement of water holding capacity (WHC)[J]. Food Eng, 2016, 175(175): 51-57.
[10] 宋平, 杨涛, 王成, 等. 用核磁共振研究浸种方法对水稻种子吸水量的影响[J]. 农业工程学报, 2016, 32(7): 237-243.
[11] 王乐, 黎勇, 胡健华. 核磁共振法鉴别食用植物油掺伪餐饮业废油脂[J]. 中国油脂, 2008, 33(10): 75-77.
[12] Sørland G H, Larsen P M, Lundby F, et al. Determination of total fat and moisture content in meat using low field NMR[J]. Meat Sci, 2004, 66(3): 543-550.
[13] 张文叶, 张磊, 吴庆伟, 等. 利用低场核磁共振技术研究山楂酒发酵过程中水分的变化规律[J]. 中国酿造, 2015, 34(12): 137-140.
[14] 刘婷婷, 王涛, 杨翼, 等. 低场核磁共振技术快速检测小球藻油脂含量及其在高通量选育中的应用[J]. 生物工程学报, 2016, 32(3): 385-396.
[15] 熊婷, 张英力, 蔡清. 基于低场磁共振技术的糖溶液检测[J].中国计量学院学报, 2013, 24(3): 219-224.
[16] 鲍晨炜, 田师一, 毛岳忠, 等. 新型长弛豫LF-NMR系统及其在茶饮料品质控制中的应用研究[J]. 中国食品学报, 2010, 10(6): 87-93.
[17] 鲍晨炜. 长弛豫LF-NMR仪器系统构建与应用方法研究[D].杭州, 浙江工商大学, 2010.
[18] Gao S, Chapman W G, House W. Application of low field NMR T 2, measurements to clathrate hydrates[J]. J Magn Reson Im, 2009, 197(2): 208-212.
[19] 陈蕾, 王灼琛, 程江华, 等. 低场核磁共振在农产品品质检测中的应用研究[J]. 农产品加工, 2015, 378(2): 1-3.。