第八章 饲料毒物分析

第八章饲料中其它有毒成分分析
本章所介绍的饲料有毒成分包括两个方面的内容：
1、饲料调制不当产生的有毒物质。

例如：许多青绿饲料加工不得法，可产生大量的亚硝酸盐；蛋白质含量高的饲料如果错误地进行发酵则可产生大量有毒的蛋白质分解产物。

这些有毒物质都可引起畜禽中毒。

2、饲料本身含有的少量有毒成分。

如棉籽饼中的棉酚、高梁苗中的氰甙等，这些饲料如果饲喂前不作去毒处理，长期大量饲喂，可引起中毒。

有毒植物本身不作为饲料，故不列为本章的内容，但在兽医临床上，特别在放牧家畜的疾病中，误食有毒植物引起的中毒时有发生，对此有兴趣的同学可参阅家畜中毒学书籍。

由于饲料中有毒成分范围广、性质各不相同，故样品处理和分析方法也没有规律性。

本章将介绍亚硝酸盐、氰化物、硫甙、棉酚的分析。

第一节亚硝酸盐分析
一、概述
青绿饲料（包括叶菜类、牧草、野菜等）及树叶类饲料，都不同程度地含有硝酸盐，其中尤以叶菜类饲料，如小白菜、青菜等含量较高，在新鲜的叶菜类饲料中硝酸盐的含量可高达数千ppm，但一般不含亚硝酸盐或含量甚微，通常多低于1ppm。

对动物来说，硝酸盐是低毒的，而亚硝酸盐则是高毒的，临床上多见的畜禽中毒都是由硝酸盐转化为亚硝酸盐而引起的。

㈠硝酸盐转化为亚硝酸盐的条件
自然界很多细菌和真菌都含有硝酸盐还原酶，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐（通常将这些微生物称为硝酸盐还原菌）。

硝酸盐还原菌的种类很多，广泛存在于土壤、水等外界环境以及动物的胃肠道和口腔等器官中。

体内外的硝酸盐还原菌如遇到适宜的条件，可大量繁殖，将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

饲料中的硝酸盐转化为亚硝酸盐，可发生于动物摄食硝酸盐以前（体外转
化），也可发生在摄入体内之后（即体内转化）。

1、体外转化
体外转化在生产实践中常见于如下两种场合：
⑴青绿饲料长时间高温堆放
青绿饲料，尤其是经虫害、踏过的青绿饲料，堆放于潮湿闷热的环境中，混杂于饲料中的某些硝酸盐还原菌得到适宜的温度、水分，大量繁殖，迅速将硝酸盐还原成亚硝酸盐。

⑵青绿饲料用小火焖煮或煮后久置
青绿饲料用小火焖煮时，煮成半生半熟，混杂于饲料中的细菌不但大多未被杀死，反而得到适宜的温度和水分。

因此，与潮湿高温堆放一样，极易促使硝酸盐转化为亚硝酸盐。

此外，煮熟的青绿饲料放在不清洁的容器中，如果温度较高，存放时间过久，亚硝酸盐的含量也可增加。

2、体内转化
即饲料中的硝酸盐被家畜采食后，经胃肠道中微生物的作用而转化为亚硝酸盐。

反刍动物（有时也见于单胃动物）在采食新鲜的青绿饲料后，有时发生亚硝酸盐中毒，其原因就在于此。

反刍动物在日粮搭配正常或富含碳水化合物的情况下，摄入的硝酸盐在瘤胃微生物的作用下还原成亚硝酸盐，并进一步还原成氨而被利用。

所以，只要摄入的硝酸盐的量同瘤胃还原能力保持平衡，则不会引起中毒。

但是当反刍动物瘤胃的pH值、还原所需的氢供给及微生物群发生变化，亚硝酸盐还原氨的速度受到限制时，摄入过多的硝酸盐，就极易引起亚硝酸盐的积累而导致中毒。

㈡亚硝酸盐中毒机理和临床症状
亚硝酸盐毒性程度主要取决于其数量。

食欲越好，吃得越多的动物，中毒机会也越多。

不同动物对亚硝酸盐的敏感性有很大的差异，其中猪最敏感，牛、羊次之。

亚硝酸盐中毒机理：
⑴亚硝酸盐是一种血液毒，其进入血液后，与血红蛋白相互作用，使血红蛋白中的二价铁氧化为三价铁而形成高铁血红蛋白（m ethemoglobin，简称MHb），又称变性血红蛋白，使血液失去携氧能力，造成组织细胞缺氧。

⑵亚硝酸盐可直接作用于血管平滑肌，松驰血管平滑肌，导致血管扩张，外周循环衰竭。

中毒家畜表现为一系列缺氧症状：高度呼吸困难，肌肉震颤，皮肤呈乌青色，粘膜发绀，血液暗红色，凝固不良。

㈢饲料中亚硝酸盐的卫生标准
饲料中亚硝酸盐允许含量（以亚硝酸钠计），在我国国家饲料卫生标准中作了规定（表8—1）
二、样品处理
亚硝酸盐是一种水溶性毒物，所以样品处理比较简单。

取样品5~10g，研碎，加水至100ml，振荡数分钟，过滤，取中间滤液10ml 作为供试液。

如果滤液中色素含量较高，可用活性炭脱色。

三、亚硝酸盐定量分析
亚硝酸盐的定量分析常采用重氮偶合比色法。

依据使用试剂不同分为盐酸萘乙二胺法和α—萘胺比色法。

两种方法均具有较好的准确度和精密度，可随意选择。

㈠α—萘胺法（格利斯法，Griess法）
1、原理：亚硝酸盐在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸反应，生成重氮盐后，再与α—萘胺偶合形成紫红色染料，与标准系列比较定量。

2、仪器与器皿
分光光度计，比色管。

3、试剂
⑴ 亚硝酸钠标准液：精密称取经115+5℃干燥至恒重的分析纯亚硝酸钠0.1495g ，用水溶解，移入100ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，此液每ml 相当于1mgNO 2-。

⑵ 亚硝酸钠标准使用液：吸取亚硝酸钠标准贮备液1ml ，置于100ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，此标准液每ml 相当于10ugNO 2-。

⑶ 对氨基苯磺酸溶液：取0.3g 对氨基苯磺酸溶于150ml12%醋酸溶液中。

贮存于棕色瓶中。

如溶液有颜色，临用时加入少许活性炭加热至80℃并进行过滤，即可脱色。

⑷ 盐酸α—萘胺溶液：取0.2g 盐酸α—萘胺溶于20ml 水中，加浓盐酸0.5ml ，微热溶解，加水稀释至100ml 。

贮存于棕色瓶中。

如有颜色，可用活性炭脱色。

⑸ 醋酸钠缓冲液：取16.4g 无水醋酸钠，溶于100ml 水中。

4、操作
取供试液2ml ，标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml ，分别加入50ml 大试管中，加水稀释至25ml 。

于标准管和样品管中分别加入0.5ml 醋酸钠缓冲液，1ml 对氨基苯磺酸溶液和1ml 盐酸α—萘胺溶液，摇匀放置10min ，以零管作参比，1cm 比色皿，于波长525nm 处测定吸光度。

根据标准管各种浓度所测定的吸收度绘出标准曲线。

根据检液所测的吸收度从标准曲线上查出检液的含量（A ），再算出样品中亚硝酸盐的含量：
亚硝酸盐含量=A×1002 ×1000m ÷1000（mg/kg ）=50A m
式中：A ——样品管测得的含量（ g ）；
m ——称取样品质量（g ）。

㈡ 盐酸萘乙二胺法（国家标准法）
1、原理 在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应，生成重氮化合
物，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准系列比色定量。

2、仪器与器皿
分光光度计，比色管。

3、试剂
⑴0.4%对氨基苯磺酸溶液：取0.4g对氨基苯磺酸溶于100ml20%盐酸中，贮存于棕色瓶中。

如溶液有颜色，临用时加入少许活性炭加热至80℃并进行过滤，备用。

一周内使用。

⑵0.2%盐酸萘乙二胺盐溶液：取0.2g盐酸萘乙二胺溶于100ml水中。

贮存于棕色瓶中。

一日内使用。

⑶亚硝酸钠标准液：精确称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解，置于500ml容量瓶中，加水稀释至刻度，此液每ml相当于200μg NO2-。

⑷亚硝酸钠标准使用液：吸取亚硝酸钠标准液5.00ml，置于200ml容量瓶中，加水稀释至刻度。

此液每ml相当于5μg NO2-。

4、操作
取七只50ml容量瓶按下表操作：
混匀，静置15min。

以零管调零，于波长538nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液中所含NO2-质量为横坐标，绘制标准曲线，或计算回归方程，根据样液的吸光度，求样液中亚硝酸盐的含量。

5、结果计算
亚硝酸盐含量（mg/kg）=A×100
2
×
1000
m
÷1000（mg/kg）=
50A
m
式中：A——样品管测得的含量（μg）；
m——称取样品质量（g）。

四、亚硝酸盐的定性分析
亚硝酸盐的定性分析方法，常用格利斯法和联苯胺—冰醋酸法，有时也用安替比林法。

㈠对氨基苯磺酸重氮法（格利斯法，Griess法）
1、原理亚硝酸盐在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸反应，生成重氮化盐后，再与α—萘胺偶合形成紫红色染料。

2、试剂
⑴对氨基苯磺酸溶液：取0。

5g对氨基苯磺酸溶于150ml30%醋酸中。

⑵α—萘胺溶液：取0.1g—萘胺溶于20ml水中，过滤，滤液加入150ml30%醋酸，混匀。

⑶格利斯试液：将⑴和⑵等量混合。

3、操作：取供试液1滴于白磁板上，加入1~2滴格利斯试液，如含亚硝酸盐，则出现紫红色。

㈡联苯胺—冰醋酸法
1、原理在酸性溶液中，亚硝酸盐能将联苯胺重氮化，然后水解并氧化成棕色的联苯醌。

用以鉴定有无亚硝酸盐存在。

2、试剂
0.1%联苯胺—冰醋酸溶液：取0.1g联苯胺溶于10ml冰醋酸中，加水稀释至100ml。

3、操作取供试液1滴于白磁板上加联苯胺—冰醋酸溶液1滴，如含亚硝酸盐，则出现棕红色。

㈢安替比林法
1、原理在酸性条件下，亚硝酸盐使安替比林亚硝酸基化，溶液呈绿色。

2、试剂
安替比林溶液：取5g安替比林，溶于100ml2N硫酸中。

3、操作取供试液2滴于滴板上，加安替比林液2滴。

如出现绿色，示有亚硝酸盐存在。

第二节氰化物的分析
一、概述
氰化物系指含氰基（CN）的化合物。

植物中的氰化物是以甙（配糖体）形式存在的氢氰酸有机衍生物（即氰甙）。

如苦杏仁中的苦杏仁甙；高梁和玉米新鲜幼苗中的蜀黍甙。

氰甙本身无毒性，但当其水解释放出游离的HCN后，就会引起动物中毒。

㈠氰甙水解产生氢氰酸的途径
氰甙水解产生氢氰酸的途径有两条：
1、酶解含氰甙的植物中都存在水解酶。

在完整的植物体内，由于氰甙与其水解酶存在于同一器官的不同细胞中，氰甙不会受到水解酶的作用，故植物中不存在游离的氢氰酸。

只有当植物完整的细胞受到破坏，氰甙与其水解酶接触，水解反应才回迅速进行。

氰甙首先在β-葡萄糖甙酶的作用下，其糖甙键水解产生α-羟腈和葡萄糖。

α-羟腈在羟腈裂解酶作用下裂解，释放出氢氰酸和相应的羰基化合物。

2、稀酸水解氰甙的β-糖甙键对酸不稳定，可被稀酸破坏，产生糖和α-羟腈，后者由于性质不稳定，可进一步分解产生氢氰酸和相应的羰基化合物。

酶解与稀酸水解两者产物相同。

㈡富含氰甙的植物和青饲料
木薯、高粱和玉米的幼苗、亚麻、络麻、海南刀豆、狗爪豆以及蔷薇科植物（如桃、梨、梅、杏、枇杷、樱桃等）的叶子和种子。

㈢氰甙中毒机理
氰基是一种非特异性的酶抑制剂，能抑制细胞内多种含金属离子的酶系统，如细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、接触酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等共40多种酶，其中最显著的是细胞色素氧化酶。

氰基抑制细胞色素氧化酶的机制是氰基能迅速地同氧化型细胞色素氧化酶的辅基三价铁离子结合，使其不能转变为具有二价铁离子辅基的还原型细胞色素
氧化酶，从而丧失传递电子、激活分子氧的作用，阻止组织对氧的吸收，破坏组织内的氧化过程，导致机体内缺氧症。

口服氢氰酸2.3mg/Kg体重即可致死。

对牛、马来说，采食含氰甙59.4%的木薯块根皮1～1.5Kg即可引起死亡。

空气中氢氰酸浓度超过0.2mg/L也可致死，所以，在做氰化物分析时应予以注意。

氢氰酸中毒发病迅速，当动物过食含氰甙的饲料15～20min，即可发生中毒现象。

中毒家畜表现为呼吸困难、呕吐、流涎、肌肉痉挛，可视粘膜鲜红色。

剖检血液鲜红色，胃肠有出血性炎症。

（亚硝酸盐：高度呼吸困难，肌肉震颤，皮肤呈乌青色，粘膜发绀，血液暗红色，凝固不良。

）
㈣饲料中氰化物的卫生标准
饲料中氰化物允许含量，在我国国家饲料卫生标准中作了规定（。

二、样品处理
由于干扰氰化物测定的物质很多，如金属离子、脂肪酸、硫化物、硫氰酸盐、甘氨酸、尿素、氧化剂、还原剂等。

因此，一般样品都用蒸馏法处理以除去干扰物质后再进行测定。

一些干扰物如用蒸馏法未能除去时，可在蒸馏前加入专门试剂消除干扰，如脂肪酸可在pH6～7 时，用异辛烷（己烷或氯仿）萃取；氧化剂用亚硫酸钠还原等，然后再蒸馏处理。

操作方法：取样品12g于500ml蒸馏瓶中，加水100ml，加酒石酸2g，然后进行水蒸汽蒸馏，以装有5ml0.1N氢氧化钠的100ml容量瓶作接受瓶，蒸馏至刻度，溜液供分析。

注意：氢氰酸是剧毒的挥发性毒物，因此，整个蒸馏装置应密闭，接受瓶最
好放在冰浴中，瓶中预先加适量碳酸钠或氢氧化钠溶液，以使氢氰酸形成氰化钠而减少挥发损失。

另外，氰化物性质不稳定，易反应生成氢氰酸而挥发，故样品应及时采集，尽快分析。

三、定性分析
氰化物的定性方法，常用普鲁士蓝法和苦味酸试纸法。

㈠普鲁士蓝法
本法灵敏度较高，常作为氰化物的确证试验。

1、原理氰化物在酸性，水解产生氢氰酸，氢氰酸在碱性溶液中，与亚铁离子作用生成亚铁氰化钠，用盐酸酸化，进一步与三氯化铁反应，生成蓝色的亚铁氰化铁，即普鲁士蓝，借以鉴定氰化物的存在。

2、试剂
⑴10%酒石酸溶液；
⑵20%硫酸亚铁溶液（需临时配制）；
⑶10%氢氧化钠溶液；
⑷10%盐酸；
⑸1%三氯化铁溶液。

3、操作
取样品5～10g于150ml锥形凭中，加蒸馏水20～30ml调成糊状，再加入5ml10%酒石酸使呈酸性，立即于瓶口盖一滤纸，并迅速于滤纸中央滴加1～2滴新配制的20%硫酸亚铁溶液，稍干后，再加1～2滴10%氢氧化钠溶液，然后将锥形瓶置于60℃的热水中，加热20～30min，取下滤纸，在滤纸上滴加10%盐酸2滴、1%三氯化铁溶液1滴。

如有氰化物存在，滤纸出现蓝色斑点。

㈡苦味酸试纸法
1、原理氰化钠在酸性条件下，水解生成氢氰酸气体，与苦味酸试纸作用，生成红色的异氰紫酸钠，可作定性鉴定。

2、试剂
⑴1%苦味酸溶液；
⑵10%酒石酸溶液；
⑶10%碳酸钠溶液；
3、操作
⑴苦味酸试纸制备将滤纸在1%苦味酸溶液中浸泡一端时间，取出，在室温下阴干。

剪成5×0.8cm的纸条，备用。

临用时再滴加10%碳酸钠溶液使之湿润。

⑵取样品10g于150ml锥形凭中，加蒸馏水20～30ml调成糊状，再加入5ml10%酒石酸使呈酸性，立即塞上挂有苦味酸试纸的塞子，使试纸条悬垂于瓶中（勿接触瓶壁及溶液）。

将锥形瓶置于40～50℃水浴中，加热30min。

如有氰化物存在，少量时试纸呈橙红色，量多时呈红色。

4、注意事项
⑴本反应非氢氰酸特有反应，亚硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物均能还原苦味酸试纸，使之呈红色或橙色，干扰本反应。

醛、酮类亦有干扰。

因此，如结果为阴性，说明没有氰化物。

如为阳性，则需进行其它试验，以便确证。

⑵加热温度不宜过高，否则大量水蒸汽将试剂淋洗下来，结果难于观察。

四、定量分析
测定氰化物的常用方法有硝酸银滴定法、氰离子选择电极法和比色法。

硝酸银滴定法为国家标准法，原理：以氰甙形式存在于植物体内的氰化物经水浸泡水解后，进行水蒸汽蒸馏，蒸馏出的氢氰酸被碱液吸收，在碱性条件下，以碘化钾为指示剂，用硝酸银标准溶液滴定定量。

滴定法适用于分析液浓度在1ppm以上。

氰离子选择电极法其原理为在pH12、0.1mol/L硝酸钾介质中，氰离子浓度在10-1～10-6mol/L之间，电位值与氰离子浓度负对数呈直线关系，可以求出样品中氰化物的含量。

本法分析浓度范围为0.05～10ppm。

比色法的灵敏度较高，其分析液浓度下限0.02ppm。

高浓度时，取部分分析液稀释之。

比色法又分苦味酸比色法和吡啶-巴比妥酸比色法。

㈠苦味酸比色法
1、原理氰化钠在酸性条件下，水解生成氢氰酸，遇碳酸钠生成氰化钠，再与苦味酸反应生成异氰紫酸钠，呈玫瑰红色。

2、试剂
⑴15苦味酸溶液；
⑵1N碳酸钠溶液；
⑶氰离子标准液：精密称取氰化钾0.25g，用少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加水稀释至刻度。

此为1.0mg/ml氰离子溶液。

将此液稀释10倍制成0.1mg/ml的贮备液。

临用时取贮备液1.0ml，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，作为使用标准液，含氰离子1.0 g/ml。

3、操作
取六支大试管按下表操作：
混匀，以零管调零，于波长538nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，氰离子浓度为横坐标，绘制标准曲线，或计算回归方程，根据样液的吸光度，求样液中氰离子的含量。

5、结果计算
氰离子含量（mg/ml）=2A
式中：A——样品管测得的含量。

㈡吡啶-巴比妥酸比色法
1、原理氰化钠在酸性条件下，可与溴反应，生成溴化氰，再与吡啶作用生成5-羟基戊二烯醛，后者与巴比妥酸反应生成紫红色化合物。

2、时机试剂
⑴溴水：取0.2ml溴液和1g溴化钾溶于100ml水中，摇匀，在暗处保存。

⑵吡啶-巴比妥酸溶液
a液：取吡啶6ml，加水4ml、浓盐酸1ml，混匀；
b液：取巴比妥酸0.1g溶于10ml水中；
将a液和b液等容量混合即成。

⑶氰离子标准液：配制方法同上。

3、操作
取7支10ml磨口刻度比色管，按下表操作：
混匀，放置30min，以零管调零，于波长580nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，氰离子浓度为横坐标，绘制标准曲线，或计算回归方程，根据样液的吸光度，求样液中氰离子的含量。

第三节棉酚的分析
一、概述
棉籽榨油后的副产品棉籽饼，不但含有多量的磷、维生素和丰富的蛋白质（30%以上），而且其蛋白质的氨基酸组成比较全面，接近于大豆蛋白质的组分，是一种很好的蛋白质饲料。

据统计，我国1981—1991年之间年平均生产棉籽饼粕374.9万吨，仅1991年达428万吨。

有人设想，若能利用30万吨就能增产肉猪600万头，增肉6万多吨。

因此，合理地利用棉籽饼作蛋白质饲料对促进畜牧业生产有重要意义。

但由于棉籽饼含棉酚（Gossypol）等有毒物质，因而在动物饲养中的应用受到了限制。

目前，国内外采用的棉籽饼粕去毒的方法是在棉籽饼粕中按其游离棉酚的含量多少来决定加入FeSO4的用量。

其比例规定为：游离棉酚︰FeSO4=1︰1。

因此检测棉籽饼中游离棉酚的含量是合理利用棉籽饼这一蛋白质饲料的必要的一个技术指标。

㈠棉酚的理化性质
棉酚俗称棉毒素，是棉花植株在生长过程中自身合成的，用于防御病虫害的防御性物质。

它是一种多酚二萘衍生物，其分子式为C30H30O8，MW为518.5，化学名称为2,2´-双1,6,7-三羟基-3-甲-5-异丙基-8-甲醛基萘酚。

棉酚存在三种异构体，即酚醛型（醇醛型），半缩醛型（内酯型）和环状羰基型（烯醇型）。

这三种异构体可发生互变。

棉酚按其存在形式可分为游离棉酚和结合棉酚。

游离棉酚或称自由棉酚（Free gossypol，缩写FG），是指具有活性基团。

即羟基和醛基未被取代的棉酚。

它对动物的毒性较大，因此，人们将它作为棉酚饼含毒素量的检测对象。

结合棉酚（Bound gossypol，缩写BG），是游离棉酚与蛋白质、氨基酸、磷脂等物质结合的复合物，它丧失了活性，也难以被消化道吸收、分解，故不呈毒性作用。

两者结合在一起称总棉酚。

㈡毒性
游离棉酚仅属低毒物质，大白鼠的LD50在2000~3000mg/kg体重，小白鼠为315mg/kg体重。

据报道，成年牛每天饲喂1.75~3kg棉籽饼，猪每天饲喂0.5kg，48～60天后可出现中毒现象，猪每天随饲料食入150mg游离棉酚可在28天左右死亡。

因此，棉酚一般不会引起动物急性中毒，只有在连续过量食入，并在体内蓄积达到一定量后才产生对动物的毒害，即动物急性棉酚中毒并不多，主要是蓄积性毒害。

不同动物对棉酚的敏感性不同，以猪和禽最为敏感，犊牛对棉酚也有一定的敏感性，但成年牛和羊对棉酚有相当的耐受性。

另外，饲料中的蛋白质和维生素A的含量对动物的敏感性也有很大影响。

目前，棉酚对动物的毒作用还不十分清楚。

一般认为，它是一种细胞毒和血液毒，能损害肝细胞、心肌细胞和肾脏，引起呼吸和循环系统障碍，同时棉酚还可以结合铁离子而干扰血红蛋白合成中铁离子的正常利用而引起贫血。

猪棉酚中毒时主要表现为食欲降低、体重减少，严重者，表现为兴奋不安，呼吸急促，尿量减少或有血尿。

剖检可见胃肠炎、中毒性肝炎、肾炎、心内外有出血点、心肌变性。

㈢饲料中棉酚的卫生标准
饲料中游离棉酚的允许含量，在我国国家饲料卫生标准中作了规定。

饲料中游离棉酚的允许含量
饲料名称游离棉酚允许量（mg/kg）
棉籽饼、粕≤1200
肉用鸡、生长鸡配合饲料≤100
产蛋鸡配合饲料≤20
生长肥育猪配合饲料≤60
二、棉酚的提取
1、游离棉酚的提取
游离棉酚的提取方法很多，最早的提取方法是用乙醚浸泡提取2~3小时。

后来有人改用乙醇—水（60︰40）、乙醇—水—乙醚（57︰27︰17）、丙酮—水（70︰30）提取。

其中用丙酮—水（70︰30）提取1小时能使脂肪的含量和结合棉酚的水解降到很低的限度，因而被美国油料化学家协会（AOCS）作为官方分析方法所采用。

但在混合饲料中，在以上提取过程中，由于用上述溶剂提取混合饲料使，饲料中的营养成分可能会与棉酚发生反应，导致回收率较低。

为此，有人推荐，在提取溶剂中加入少量的稳定剂3—氨基丙醇，即在940ml异丙醇—正乙烷（60︰40）混合液中加2ml3—氨基丙醇，8ml冰醋酸和50ml水。

另外，丁酮—水共沸混合物—苯胺溶液也适合于混合饲料中游离棉酚的提取，此液的配制方法是这样的：2-丁酮—水（10︰1）混合液蒸馏，收集73℃的共沸混合物，取5ml苯胺溶解于共沸混合物中，并稀释至1000ml。

2、总棉酚的提取
总棉酚的提取方法有两种：一种是用热的苯胺—乙醇混合液或者用3—氨基丙醇—二甲酰胺直接提取，另一种是用草酸将结合棉酚水解，再用丁酮—水共沸混合物提取。

其中，3—氨基丙醇—二甲酰胺提取法还用于混合饲料中总棉酚的提取。

三、棉酚的测定
棉酚的测定分总棉酚和游离棉酚的测定。

棉酚测定主要用比色法，比色法有苯胺法、SbCl3法、甲氧基苯胺法、间苯三酚法、紫外分光光度法等。

苯胺法和甲氧苯胺法精密度和准确度均好，是常用的被认为是准确定量的方法。

三氯化锑法是利用棉酚与SbCl3的氯仿溶液显鲜红色而定量，它是以往常用的方法，但因SbCl3遇水易生成浑浊沉淀，操作需严格细致，稍不注意比色液易浑浊，导致分析失败。

间苯三酚法是利用样液中的棉酚和间苯三酚在弱酸性溶液中（6mol以上盐酸溶液）生成有色络合物，络合物的
max在550nm，颜色深浅与含量成正比而进行比色测定。

其快速、简便、灵敏度高，但精密度比苯胺法稍差，是目前常用的快速分析方法。

UV分光光度法利用棉酚的环已烷在236、286、258nm处均有吸收峰这一性质而进行含量测定，其简便、快速，但干扰物太多，准确度和重现性较差。

国家标准方法
1、原理：在3-氨基-1-丙醇存在下，用异丙醇与正已烷的混合溶剂提取FG 和用二甲酰胺提取总棉酚，苯胺与棉酚结合，生成黄色化合物，在最大吸收波长440nm处进行比色测定。

2、试剂
⑴异丙醇—正已烷混合溶剂（60：40，V/V）
⑵苯胺：如果测定的空白试验吸收值超过0.022时，在苯胺中加入锌粒进行蒸馏，弃去开始和最后的10%蒸馏部分，放入棕色的玻璃瓶内贮存在0~4℃冰箱中，该试剂可放置几个月。

⑶试剂A：在约500ml的异丙醇—正已烷的混合溶剂中加入2.0ml3—氨基—1—丙醇、8.0ml冰醋酸和50ml水，于100ml容量瓶中，再异丙醇—正已烷混合溶剂稀释定量至刻度。

⑷溶剂B：取2.0ml3—氨基丙醇和10ml冰醋酸于100ml容量瓶中，用二甲酰胺定容至刻度。

⑸棉酚标准液A：取25mg纯棉酚溶于溶剂A中，并定容至250ml （0.10mg/ml），取此液50.0ml再用溶剂A定容至250ml（0.02mg/ml）作为应用液，静止1小时后使用。

⑹棉酚标准液B：取25mg纯棉酚溶于溶剂B中，并定容至50ml （0.5mg/ml）。

3、操作
⑴游离棉酚的测定
①标准曲线制备。