植酸酶酶活测定

四.实验步骤： 实验步骤：
1. 标准曲线的制作
(1)按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液 (1)按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液
标准符 标准 号 磷液 /ml 蒸馏 水/ml 相当于 无机磷 /ug 显色液 /ml OD660nm
1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0
0.9ml（TCA） 0.9ml（植酸 （ ） （ 钠） 3ml √ 3ml √
水浴显色20min 水浴显色
20分钟后， 20分钟后，四只 分钟后 试管中现象
用分光光度 计测OD值 计测 值
实验得到四只试管中的样液的OD值 值 实验得到四只试管中的样液的
A0(参照 = 0 A1= 0.547 参照) 参照 A2= 0.490 A3= 0.523
实验用品： 三.实验用品： 实验用品
• 试剂 乙酸缓冲液、植酸钠溶液、10%三 试剂：乙酸缓冲液、植酸钠溶液、 乙酸缓冲液 三 氯醋酸溶液、 钼酸铵溶液、 氯醋酸溶液、2.5%钼酸铵溶液、10%Vc 钼酸铵溶液 溶液、 硫酸溶液、 溶液、17%硫酸溶液、磷酸二氢钾、显色 硫酸溶液 磷酸二氢钾、 液配制： ） 液配制：（6）︰（水）︰（4）︰（5）=1︰2︰1︰1 ） ） ︰ ︰ ︰ • 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、 烧杯、容量瓶、 烧杯、容量瓶、移液管
摇瓶
3000r/min离心 min 离心15
（2） 酶活测定 ）
反应顺序
1. 加酶液 2. 加植酸钠 加植酸钠/TCA溶液 溶液 3. 加乙酸缓冲液 4. 混合均匀 5. 37℃水解 ℃
样品
0.3ml 0.9ml（植酸钠） （植酸钠） 0.9ml √
样品空白
0.3ml 0.9ml（TCA） （ ） 0.9ml √
0 2 4 6 8 10
3 3 3 3 3 3
根据上述进行实验操作
6只试管从 左到右依次 编号1~6， 按照表格里 的要求加液
（2）显色反应： ）显色反应：
将反应液立即摇匀， 将反应液立即摇匀 37℃水浴保温 ℃水浴保温20min 20min后 后
试管中液体冷却至660nm测OD值 试管中液体冷却至660nm测OD值 660nm
个植酸酶活性单位，以U表示。 表示。 个植酸酶活性单位， 表示 • 在酸性溶液中正磷酸与钼酸作用生成磷钼 后者当有还原剂存在时， 酸，后者当有还原剂存在时，立即转变成 蓝色的还原物，其最大吸收在660nm波长 蓝色的还原物，其最大吸收在 波长 比色的最适范围为1~10ug无机磷。 无机磷。 处，比色的最适范围为 无机磷
结果表示: 结果表示:
把A1、 A2、 A3代入直线方程可得
m1=16.6 m2=14.87 m3=15.87 再把m 代入酶活方程得： 再把 1,m2,m3代入酶活方程得： 0.0595U/ml,0.0533U/ml,0.0569U/ml 即59.5 U/L,53.3 U/L,56.9 U/L。 三次平行样品的测定结果用算术平均值 表示：（ ：（59.5+53.3+56.9）/ 3=57 U/L 表示：（ ）
水浴30min（精确） （精确） 水浴
取4只10ml试管标号 只 试管标号1~4，按以上顺序进行 ， 试管标号 操作，以空白实验为参照液37℃水解， 操作，以空白实验为参照液 ℃水解，水 浴30min
水浴恒 温 30min
恒温水浴之后进行以下顺序操作
6. 加TCA/植酸 植酸 钠溶液 7. 加显色液 7. 混合均匀 8. 37℃水浴 ℃
测得试管 1~6的OD值 的 值 为:0.000 0.066 0.138 0.195 0.26图，并列出直线回归方程
吸 光 度
无机磷浓度/ug
2 样品中植酸酶活力测定
（1） 酶液制备 ）
• 取实验五中的摇瓶培养液为试样，在离心机上 取实验五中的摇瓶培养液为试样 3000r/min离心 离心15min 以3000r/min离心15min
五.实验结果与分析
酶活= 酶活
n m F× C F× V F × M F ×m = = = (U / ml) 30 30 30 × V 30 × 31× V
注: F—试样溶液反应前的总稀释倍数,本实验未稀释所以F=1 m—根据实际样液的吸光值回归方程计算出无机磷的质量,u g 30—反应时间，min 31—磷的摩尔质量，g/mol V —实际取酶液样品的体积，ml
植酸酶酶活测定
实验目的： 一.实验目的： 实验目的
学习和掌握植酸酶酶活的 学习和掌握植酸酶酶活的 植酸酶酶活 测定的原理及方法。 测定的原理及方法。
二.实验原理： 实验原理：
• 植酸酶酶活性单位定义：样品在植酸酶钠浓度为 植酸酶酶活性单位定义： 酶活性单位定义 5.0m mol/L,温度 ℃，pH 5.50的条件下，每分 温度37℃ 的条件下， 温度 的条件下 钟从植酸酶钠中释放1 无机磷， 钟从植酸酶钠中释放 µmol 无机磷，即为一