益气活血方对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响

2020年第35卷第6期Vol.35No.62020
河北中医药学报
JOURNAL OF HEBEI TCM AND PHARMACOLOGY・1・益气活血方对
肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响
石家庄市中医院脾胃科
孟萍南月敏△赵素贤△（石家庄050051）
提要目的：研究益气活血方在CC.诱导的大鼠肝纤维化模型中抑制肝细胞凋亡、阻止肝纤维化进展的作用及机制。

方法：将27只Wistar大鼠随机分为3组，模型组和益气活血方治疗组腹腔注射35%CC.橄榄油溶液，对照组腹腔注射等量橄榄油。

益气活血方治疗组以益气活血方中药配方颗粒剂溶液灌胃，另2组大鼠以5.9%氯化钠溶液灌胃。

HE、Masson染色观察大鼠肝纤维化程度；肝组织凋亡相关基因FasL、Fat、Br、Bel-2、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）mRNA表达以qRT-PCR检测，蛋白表达以Western Blot检测。

结果：模型组大鼠肝小叶结构紊乱，纤维组织增生形成纤维间隔，并可见假小叶，伴随FasL、Ft、、caspase-3mRNA及Bs mRNA及蛋白表达上调，Bel-2mRNA及蛋白表达下调，与对照组比较差异有非常显著性（P均＜5.51）。

应用益气活血方肝纤维化明显减轻，FasL、Fas、caspase-3mRNA和Bax mRNA及蛋白表达明显抑制，Bel-2mRNA 及蛋白表达明显上调（P均＜5.55）。

结论：益气活血方可通过抑制肝细胞凋亡发挥抗炎抗肝纤维化作用。

关键词益气活血方；肝纤维化；肝硬化；；臓胀；凋亡；四氯化
中图分类号：R280.9文献标识码：A文章编号：1057-5615（2525）56-0051-55
Effect of Yiqi Huoxue Recipe on Hepatocyte Apoptosis in
Rats with Hepatiy Fiprosii
Depdnnmet of Spleee and Stomach，Shijiazhuang Hospital of Trasitional Chinese Medicine
MENG Ping NAN Yue-min ZHAO Su-xian(SPijiazhuane550551)
Abstroci Objective:To study the ePect and mechanism of Yiqi Huoxue Recipe cm inhibiting hepatocyte apoptosis and prevepting Over fibrosis procressiop in liven fibrosis rat induceP by CC10.Methoos:Twenty sever Wistae rats were randomly divided into three groous-The mooel group and the treatmeei group with Yiqi Huoxue Recipe were intraperitopeclly injected with30%CC1O olive oil solo-tioo，while the coptrcl groop was injectee with the same amopat of olive oil.The meatmept groop was given Granule soluaop of Yiqi Huoxue Recipe by gavage,and the othee tmc gropps were givee5.9%sodium chloriUe soluaop.HE and Massco staining were used I o observe the Ueeree of liver fibrosis；the mRNA expressioo of apoptosis related genes FasL,Fas,Ba、,Bcl-5and caspase-3were Uetec-tee by qRT-PCR and protein expressiop was Uetectee by Western Bloi.Results:Id the moPei gropp，the structure of hepatic ybCe was UisorUeree,fibrops tissue aroliferateU to form fiProps septum,and pseuPoybae was observeU.The expressiop of FasL,Fas，caspase-3mRNA，Bap mRNA and protein was up-repulateP，and the expressiop of Bcl-5mRNA and protein was Uowd-repulateP.There was sipnificaat differedee compareU with the moPei gropu(P<5.51).The results sPoweP that Yiqi Huoxue Recipe code sipnificantly ate-viate—ver fibrosis，inhibit the expressiop of FasL,Fas，caspase-3mRNA，Bap mRNA and protein，and up repul a te the expressiop of bcl-5mRNA and protein(P<5.56).Coaclusiop:Yiqi Huoxue Recipe can play an anti-inOammatora and anti-fibrosis effect by indip-itind hepatocyte apoptosis.
Keywords Yiqi Huoxue Recipe;liver fibrosis；ciirhosis；acchmdatmp；dismpsiop；apoptosis；carnop mmachloriPe
肝纤维化指肝脏细胞外基质过量堆积致肝组织
异的程。

肝细
*河北省中医药管理局科研计划项目：No2020314
△河北医科大学第三医院中西医结合肝病科（石家庄056065）
通讯作者：南月敏，女，博士、主任医师。

胞凋亡肝的表现，研究发现，⑴伴随肝的凋亡对肝脏炎症及纤维化，与肝纤维化的持续进展相关。

中药分、及性高的特点，在肝纤维化治疗中具有明显的优势。

研究证
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实，益气活血方可调节肝细胞自噬，减轻肝损伤, 抑制肝星状细胞（HSC ）活化，促进转化生长因子 01 （TGF-01）、W 型胶原等降解，进而阻止或逆
转肝纤维化o [2-1 *3]然而，其对肝细胞凋亡的影响尚 不十分清楚。

本研究中，我们利用CC.诱导大鼠 肝纤维化模型，探讨益气活血方是否通过调节死亡
受体途径Fas/FasL 及线粒体途径Bel - 2/Bax 的表
达发挥抗肝纤维化作用。

1. 9 肝组织 Bax 、Bel -2、ces/aso - 3 蛋白表达
取肝组织22 me ，加蛋白裂解液1 mL ，4O C 研磨
， 经 心分 制备蛋白。

用 BCA 蛋
白定量试剂盒定量，每组取总蛋白22隅上样，
11%SDS -PAGE 分离蛋白质，湿转恒流37 mA 44
mm ，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶
粉室温封闭1 h ，分别加入GAPDH （1：10 000）、 Bax （1 ： 1 000）、Bel - 2 （1 ： 1 000）、caspase - 3
（1：1 000）抗体，4C 孵育过夜。

充分洗涤，分别
化物酶标 兔 大鼠 二 体
（1：20 000），室温孵育1 h ，充分洗涤后，发光、
1材料与方法
1. 1 实验动物及主要试剂 选用27只雄性 Wistar 大鼠，体质量180 -220 g ，购买于河北医科
大学实验动物中心。

兔抗GAPDH 抗体购自美国
Affinity 公司；兔抗Bel -2、兔抗Bax 、兔抗天冬氨
酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3 （ ces/as/ - 3 ）抗体
购自英国Abcem 公司；山羊抗兔二抗购自美国
ProteinTech 公司。

益气活血自拟方以黄Z 、丹参、 云茯苓、白豆蔻、郁金等中药配伍组成，由江阴天
江药业有限公司免煎颗粒剂制备冲剂。

8.3动物模型建立及标本采集实验大鼠随机
分为对照组、模型组和益气活血方治疗组，每组9 只。

模型组和益气活血方治疗组大鼠腹腔注射
30%CCl 4橄榄油溶液（0. 3 mL180 g 体质量），对 照组大鼠以相同方法给予等量的橄榄油，2次/周。

建模的同时，益气活血方治疗组大鼠以自拟益气活
血方中药配方颗粒剂溶液灌胃（mL/180 g 体质
量），其他2组大鼠灌胃等量的0.9%氯化钠溶液,
1次/d 。

于第0周末处死实验大鼠，取出肝脏，适 量肝组织以4%中性甲醛溶液固定，余肝组织经液
氮快速冷冻，-80T 低温冰箱保存备用。

1.3肝脏组织病理学检查固定后的肝组织经 透明、包埋、切片，行HE 染色及Masson 三重染
色。

于光镜下观察肝纤维化程度。

每个标本随机选
取5个视野，参照CC.4肝纤维化新型分期标准⑷， 对肝纤维化进行评估。

1.9 肝组织 FasL 、Fas 、Bax 、Bel -2、ces/aso -3 mRNA 表达 采用qRT-PCR 法，各基因引物
序列见表1 TOzot 试剂提取肝组织总RNA ，应用
PrimeScrip 严RT reagent Kit （日本 Takara 公司）逆
转录合成cDNA ，以GAPDH 作为内参照，应用 ABI 7500实时荧光定量PCR 仪进行cDNA 扩增,
反应体系为22 结果运用2-aa ct 法进行分析。

详见表1。

表1
qRT-PCR 基因引物序列
基因
产物长度（bp ）
物
FaL
127
F5'-TCACCACTACCACCGCCTTCC - 3'R5'-CCATTCCAACCAGAGCCACCAG - 3'Fa/99
F5'-GTCCTGCCTCTGGTGCTTGC-3'
R5'-TTCACGAACGCTCCTCTTCAACTC-3'Bel-2
166F5'-ACGGTGGTGGAGGAACTCTTCAG-3'R5'-GGTGTGCAGATGCCGGTTCAG-3'Ba
133
F5'-CCAGGACGCATCCACCAAGAAG-3'R5'-GCTGCCACACGGAAGAAGACC-3'caspase - 3
04
F5'-GTACAGAGCTGGACTGCGGTATTG-3'R5'-AGTCGGCCTCCACTGGTATCTTC-3'GAPDH 252
F5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'R5'
-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'
显影、定影、曝光、扫描，以GAPDH 为内参照。

用 将 酸纤维 上的蛋白
机，应用Quantity One 软件分析条带灰度。

目的蛋 白灰度值与内参照蛋白灰度值的比值即为目的蛋白 表达量。

1.9 统计学方法 数据处理应用SPSS16.9软
件。

多组间比较采用单因素方差分析，采用LSD -
t 检验进行两两比较。

P <0. 95为差异具有显著性。

2结果
2.1 益气活血方可减轻CC44诱发的大鼠肝纤维 化如图1所示，对照组大鼠肝小叶结构完整，未
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孟萍，等：益气活血方对肝纤维化大鼠肝8胞凋亡的影响-3-
见纤维结缔组织增生（S0）。

模型组大鼠肝小叶结,纤维组织纤维，假小叶（S5.49±0.23）。

应用益气活血方大鼠肝纤维化显
,肝基本存在（S3.69±0.91）,与模型组相比，差异性（P<0.001）,见图2。

■fii
.r
fi
B
注：A HE染色结果（X200）;B Masson染色结果（x200）。

图1各组大鼠肝组织病理学变化
疫型组盘化活血方俎
图2肝纤维化模型组与益气活血方治疗组
肝纤维化分期比较
2.2实验大鼠肝组织FasL、Fas mRNA表达
如图3A所示,qRT_PCR检，肝纤维化模型组FasL、Fao mRNA表达与对照组相比均显
高（P值均<0.01），应用益气活血方组大鼠肝组织FasL、Fas mRNA表达水平较模型组明显降低（P值均<0.05）。

2.3实验大鼠肝组织Bax、Bcl-2mRNA及蛋白表达如图3（B、C、D）所示，qRT-PCR及Western blot检测结果，肝纤维化模型组大鼠肝组织Bax mRNA和蛋白表达与对照组相比
，而Bcl-2mRNA和蛋白表达（P值均<0.01）；使用益气活血方干预，Bax mRNA和蛋白表达较模型组明显下调，而Bcl-2mRNA及蛋白表达较模型组上调（P，<0.05）。

2.0实验大鼠肝组织caspase-3mRNA及蛋白表达3（B、C、D），肝纤维化模型组caspase-3mRNA表达明显高于对照组（P <00001），用益气活血方组模型组降（P<0.01）o Western blot结果显zj\，caspase-3蛋白表达各组间无明显差异（P>0.05）。

3讨论
肝纤维化体对慢性肝损伤的一种
，肝的程。

注射CC.为建立肝纤维化模型经典方法，用于防治肝纤维化药物筛选及其作用机制的研究。

本研究制经典的CC.动物模型⑸，注射8周后观察发，随着cco应用，大鼠肝组织纤维组织增，纤维化分期达（S5.49±0.23），说明肝纤维化大鼠模型制备。

肝纤维化中医“积聚”“臓胀”等范畴。

中药组方在临床上应用于肝的及治疗,起到调节免疫，保护肝脏，逆转肝纤维化等作用。

益气活血方由黄Z、丹参、云茯苓、白豆蔻、郁金组方。

方中黄Z为君药，补气升阳、益卫固表、利水退肿，可促进HSC凋亡，降低胶原沉积，推动胶原降解，降低TGF-01
的含
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量，且、免疫调节及化，肝纤维化。

⑷丹参活血祛瘀、凉血安神，可抑制静止HSC 活化，强自然杀伤细胞的活化以清除活化的HSC,下调肝组织TGF-0表达o[7-8]云茯苓利水渗湿、健脾，可对抗自由基、抑制肌体的脂质化」9白豆蔻可化湿行气、温中止呕，调节TGF-0表达，抑制细胞外基质的，缓解肝纤维化程度O[I4]郁金活血止痛、行气解郁、利胆退黄的，肝，肝组织及化激，调节肝细胞免疫，阻止肝细胞凋亡o[I1-I4]本研究在应用CC.造模的同时予益气活血方灌胃进行,肝组织纤维组织减少，纤维化分期降至(S3.64±0.41),提示益气活血方胶原组织沉积，阻止并逆转肝纤维化。

Q驸馭袒□複!I!迫口益吒活血方粗
注：A FaL、Fat mRNA水平变化；B Ba、、Bal-2及caspase-3mRNA水平变化;
C、D Bax、Bel-2及caspase-3蛋白表达变化。

图3肝组织凋亡信号通路因子mRNA及蛋白表达变化
研究发现，肝细胞凋亡在肝纤维化的形成和发展中要的作用，凋亡肝细胞诱导巨噬细胞、HSC及Kupffe细胞吞噬凋亡小体，致使促纤维化因子分泌增多并激活HSC,引起肝纤维化o[13]为了进一步明确益气活血方缓解肝纤维化的分子机制，本研究观察了不同组别大鼠肝组织凋亡通路因子的表达变化。

研究，经CC.注射8周的肝纤维化模型组FasL、Fas表达明显上调，应用益气活血方，抑制FasL、Fas的表达，表明肝纤维化的、发展与FasL、Fas的表达及其诱导的肝细胞凋亡有关。

Fas是细胞膜表面受体蛋白，其细胞内区传导“死亡信号”的域与FasL；活化，诱导下游内在及外在细胞凋亡信号转导通路，诱发肝细胞凋亡而致肝纤维化的发
和展。

线粒体介导的凋亡要受Bel-2家族调控，Bel-2和Ba、分别为家族中抗凋亡和促凋亡的调控基因。

肝细胞凋亡时，Ba、可破坏线粒体膜的性，使线粒体膜电位降低，细胞色素C 释放，进而与凋亡蛋白酶活化因子-1结合激活caspase-9前体，然后激活caspase-3等，从而诱导细胞凋亡;[14-15h Bel-2则在线粒体；发作用，以维的完整性」4〕MitchelO4]等用Bel-2转基因小鼠肝纤维化模型，发现肝细胞Bel -2过度表达在肝早期可对抗肝，其机制与线粒体障碍及 化有关。

本研究,Ba、在肝纤维化模型组上调，而Bel-2明显下降，
经益气活血方干预后,
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孟萍，等：益气活血方对肝纤维化大鼠肝8胞凋亡的影响
Bax的表达明显降低，Bel-2有所升高，说明益气活血方可阻止肝细胞凋亡，减轻肝损伤。

cas/ase家族是一种半胱氨酸蛋白酶，正常情况下，caspase-3以无活性的酶原形式存在于细胞内。

当作为传感器的细胞表面死亡受体Fas接受由 死亡配体FasL发出的死亡信号，使Fas激活，并传递到细胞内，激活caspase家族成员，借助凋亡信号结构域(死亡效应域、casaase"募集”结构域)导致casaase成员相继激活，最终使casaase-3激活，进而降解特定的靶蛋白，导致细胞死t o[10]cas/ase-3是死亡受体通路、线粒体通路及其内质网应激通路的汇聚点，是凋亡过程的中心环节和关键执行者。

"9本研究发现，模型组cas/ase -3mRNA的表达较对照组明显上调，益气活血方干预后cas/ase-3表达减少，表明由于Fas的激活，进一步通过信号转导激活cas/ase-3，与疾病的进展密切相关，随着纤维化的形成而表达增强，促使细胞凋亡。

研究证实，在大鼠模型中应用cas/ase阻滞剂可抑制肝细胞凋亡，明显减轻肝纤维化。

20
笔者研究发现，益气活血方可抑制CC.4导致的肝细胞凋亡，阻止肝纤维化进展，其可能的机制为：CC.诱导可产生大量的自由基，在细胞膜上发生脂质过氧化反应，生成氧自由基增多，激活FasL/Fas系统，进一步激活cas/ase家族中的cas/ase-3，形成蛋白酶促级联反应，激活核酸内切酶，致DNA断裂、染色体浓缩，最终导致细胞凋亡。

而益气活血方可对抗自由基，降低肝组织氧化激，抑制FseL1Fse统的激活，上调线粒体途径Bel-2/Bax比例，继而抑制cas/ase-3的激活，从而抑制细胞凋亡。

综上所述，益气活血方对CC.所致的大鼠肝损伤起到保护作用，其机制可能通过抑制肝细胞凋亡，有效阻止或延缓肝纤维化的形成。

益气活血方抗纤维化机制的研究结果为其在临床的应用提供了。

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(2222-09-01收稿)。