拮抗细菌对芒果炭疽病生物防治研究进展

拮抗细菌对芒果炭疽病生物防治研究进展
潘朝勃;莫贱友;李其利;郭堂勋;黄穗萍;韦继光
【摘要】芒果炭疽病是芒果主要病害之一,筛选拮抗细菌对其进行防治已成为研究热点.文章简述了近年来拮抗细菌对芒果炭疽菌的抑菌作用及对炭疽病的防病作用,指出利用拮抗细菌防治芒果炭疽病的研究在菌源、抑菌机理、防病机制及安全等问题上尚缺乏深入、系统的研究,提出高效及拮抗机制多样化菌株的筛选、抑菌物质的抑菌机理及其合成应用、拮抗细菌对芒果诱导抗病的刺激应答机理及拮抗细菌应用的安全评估等应是今后研究工作的重点.
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】2013(044)004
【总页数】5页(P602-606)
【关键词】拮抗细菌;芒果炭疽病;生物防治;研究进展
【作者】潘朝勃;莫贱友;李其利;郭堂勋;黄穗萍;韦继光
【作者单位】广西大学农学院,南宁530005;广西农业科学院植物保护研究所,南宁530007;广西农业科学院植物保护研究所,南宁530007;广西农业科学院植物保护研究所,南宁530007;广西农业科学院植物保护研究所,南宁530007;广西大学农学院,南宁530005
【正文语种】中文
【中图分类】S436.67;S432.44
0 引言
芒果炭疽病主要由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，是芒
果生长期间和采后发生最严重的病害之一，在世界各芒果产区均有发生（Govender et al.，2005；张鲁斌等，2010）。

该病菌以分生孢子侵染植物的叶梢、花穗、果，引起梢枯、叶斑、落叶和落花落果等，并能潜伏在果实上在采后贮运期引起果实腐烂（冯双庆等，1991）。

一直以来，化学防治是植物病害防治的
主要手段并起着重要作用，避免和挽回了一定的经济损失，但同时带来了病菌抗药性、环境安全和食物安全等问题且日益严重（Budi et al.，2000；Patin-Vera et al.，2005）。

近年来，利用拮抗细菌防治植物病害成为研究热点，并取得了一定
成果，使生物防治策略得到迅速发展（Bloemberg and Lugtenberg，2001），而且细菌在地球分布广泛，种类繁多，资源丰富，利用细菌作为植物病害防治材料具有明显的资源优势。

本文就近年来国内外利用拮抗细菌防治芒果炭疽病的研究进展进行综述，以期为芒果炭疽病防治提供参考。

1 拮抗细菌对炭疽菌的抑菌表现
目前报道的拮抗细菌有土壤细菌、植物内生细菌及海洋细菌等，在种类上最常见的是芽孢杆菌。

拮抗细菌的筛选手段多采用平板拮抗测试法，通过平板上的拮抗现象挑选初级目标细菌。

在平板上拮抗细菌对病菌的拮抗现象主要表现为抑制病菌菌落生长。

大多数拮抗菌株能分泌出拮抗物质以抑制芒果炭疽菌菌丝的正常生长，在显微镜下可见受抑菌丝发生形态变态如分枝过度、粗大、扭曲、膨大、原生质浓缩凝聚，甚至胞壁破裂出现胞内物质外泄等（柳凤等，2010b）。

大多数拮抗细菌的拮抗物质对病原菌菌丝抑制生长的同时对其孢子也有抑制萌发作用（Hossain et al.，2009），如张荣意等（1998）分离的3株芽孢杆菌的培养液滤液不同程度地抑制分生孢子萌发，其抑制程度一般是随着拮抗物质浓度的提高而依次表现为分生孢子
畸形萌发、完全抑制萌发和孢子破裂。

除了对菌丝生长及孢子萌发具有抑制作用外，拮抗物质还可以影响病菌的产孢率，经拮抗物质处理后在一定程度上降低了病菌在菌落上的产孢量（陈宝如等，2010）。

2 拮抗细菌对炭疽菌的抑菌方式
拮抗微生物的抑菌方式主要是通过分泌抑菌物质或竞争营养、水分、空间等方式而达到抑制或杀灭病菌的效果（Curtis et al.，2010），其中研究最多、最常见的是分泌抑菌物质方式。

拮抗细菌产生的拮抗物质种类已有比较深入的研究，主要有两类：一是小分子的抗生素，二是大分子的拮抗蛋白或细胞壁降解酶类。

芽孢杆菌产生的拮抗物质主要有脂肽抗生素、多肽抗生素、细菌素、细胞壁降解酶及一些未鉴定的拮抗蛋白（陈海英等，2008）。

但在芒果炭疽菌拮抗细菌的研究中关于具体
拮抗物质种类的报道相对较少，目前报道常见的是蛋白类和非蛋白类。

杨胜远等（2004a）从芒果园土壤中分离获得的一株芽孢杆菌的发酵液上清液中分离到的抗菌物质，推测为氨基糖苷类物质，这类物质是一个或多个羟基基团被糖基取代的氨基环醇类化合物。

柳凤等（2010b）从红树林分离到的解淀粉芽孢杆菌产生对芒果炭疽菌具有拮抗作用的活性物质，是一类难溶于有机溶剂而易溶于极性溶剂的非蛋白质类物质。

而汪远等（2011）从红树植物秋茄（Kandelia candel）中分离得到的一株解淀粉芽孢杆菌产生的是热稳定、对紫外线不敏感的蛋白质类拮抗物质。

可见，同种类的拮抗细菌能产生蛋白类和非蛋白类的拮抗物质，可能是培养条件不一样所至。

纯蛋白质类拮抗物质在适当的蛋白酶类的分解作用下，其起活性必须的结构可能会被破坏而致使拮抗蛋白失活，但多数在酸碱环境中表现稳定。

柳凤等（2010a）从解淀粉芽孢杆菌AiL3菌株胞外物中提取到的拮抗蛋白在蛋白酶
K和胃蛋白酶作用后其拮抗活性消失，而在pH 2～11室温下处理12 h后，其拮
抗活性仅下降了0.88%～13.27%，说明强酸碱对某些蛋白类拮抗物质的活性结构影响不大，其高级结构的变化并不直接影响活性中心。

除了芽孢杆菌外，其他属的拮抗细菌也有研究报道。

Costa等（2008）从香蕉根
围分离到的伯克氏菌（Burkholderia spinosa）的发酵液对芒果炭疽病菌
（C.Gloeosporioides）菌落抑菌率约70.3%，能使芒果炭疽病发病率降低28%。

Santos-Villalobos等（2012）从芒果根围分到的一株Burkholderia cepacia XXVI在平板上对C.gloeosporioides菌落抑制率在90%以上，认为该菌株能产生含天冬氨酸异羟肟酸的铁载体代谢物，该代谢物能耐121℃高温，无挥发性，其
活性中心可能是去铁胺甲磺酸类物质。

3 拮抗细菌在防治芒果炭疽病中的应用
目前，利用筛选出的拮抗细菌对芒果炭疽病进行防病试验基本获得一定防效，具有潜在的应用前景。

余莎等（2011）利用解淀粉芽孢杆菌AiL3菌株的含
1‰Tween-80的发酵液10倍稀释液进行室内果实防病试验，结果6 d后对芒果炭疽病的防治效果为53.7%，而20%施保克500倍液对照处理组的防效为27.0%；在田间小区试验中则是含1‰Tween-80无菌上清液高于其发酵液，10 d时叶片
和果实的防效分别为47.5%和41.2%，20%施保克500倍液处理组为37.5%和50.7%。

王兰英等（2012）用内生枯草芽孢杆菌HBS-1发酵液10倍稀释液防治
采后芒果果实炭疽病的防效达84.50%，极显著高于化学药剂特克多800倍液的防效。

Silimela和Korsten（2007）研究一株Bacillus licheniformis的商业制剂单独施用及利用该菌的营养肉汤培养液在芒果叶片表面的附着及菌体生长群落的形成时，发现前者很难在叶片上附着与生长，而后者容易生长与形成群落生长结构，且大部分菌体伸出放射状丝状物攀附在叶片表面，可能借以固定菌体不易掉落而在表面定殖。

商业制剂不如培养液，可能与制剂中活菌生存与营养条件有关，特别是菌体所处的生长期对细菌在植物上定殖有极大关系。

拮抗细菌制剂与化学药剂混用可以减轻使用化学药剂带来的弊端，但要注意拮抗细菌对化学药剂的敏感性，不能混用者
可交替使用，以减少药剂的使用量。

如从开花到果实收获单独使用Bacillus licheniformis或与氧氯化铜杀菌剂交替使用（交替期为3周），可在一定程度上控制芒果炭疽病，但交替期不宜过短，因为氧氯化铜在一定时间内能抑制Bacillus licheniformis生长。

除了在种植生长期的防病应用外，采后防病同样重要。

采后病害给芒果储运及食用造成极大影响，在此阶段用化学防治则更显安全问题，而利用安全的生防制剂可避免此类问题。

目前利用具有拮抗作用的生防细菌防治芒果采后病害（主要是炭疽病和蒂腐病）已获得一定的防效，如在南非的比勒陀利亚已制成Bacillus licheniformis的水制剂和粉制剂，单独使用或与一些杀菌剂如咪鲜胺混用均起到防治采后炭疽病的效果（Govender and Korsten，2006）。

此外，Kefialew和Ayalew（2008）报道分离到Brevundimonas diminuta、Stenotrophomonas maltophilia、Enterobacteriaceae的拮抗菌株，其发酵液与发酵液滤液均对芒果炭疽菌的分生孢子萌发和菌丝生长有较强的抑制作用并具有一定的防病效果，其中Brevundimonas diminuta的防效较显著，与55℃热水处理5 min的防效相当。

4 拮抗细菌的防病机理
利用拮抗细菌对病害进行防治主要分为直接作用和间接作用。

直接作用是拮抗细菌本身或胞外分泌物在植物组织上对病原起到抑制作用（拮抗物质抑菌和竞争等），间接作用主要是通过拮抗细菌本身或胞外分泌物刺激诱导植物产生或增强对病原的抵抗力，这种诱导抵抗力通常表现为植物体内防御酶类的含量和活性的变化，以及植物组织新陈代谢的变化。

研究表明拮抗细菌菌体本身及其分泌的胞外物质可以提高芒果叶片和果实的防御酶类活性，从而增强这些叶片和果实对芒果炭疽菌的抵抗能力，这是拮抗细菌防病机制之一。

任建国等（2002）在室内离体叶片及田间试验显示喷施蜡状芽孢杆菌j-
15菌株菌液后处理叶片的PAL、PPO、POD较对照组出现不同程度的提高，且表现出明显的防病效果。

许多细菌能合成几丁质水解酶并以此完成其生命活动如分解几丁质而获得生存营养（Cohen-Kupiec and Chet，1998），同样很多植物也有合成几丁质水解酶的能力，这是在进化过程中形成的一种重要的抵抗真菌病原的自我防御机制，有些还具有接受细菌刺激而引起的特异性诱导机制（Jung et al.，2008）。

C.gloeosporioides细胞壁含有几丁质和β-1，3-葡聚糖，而植物能产生几丁质酶（chitinase）和β-1，3-葡聚糖酶（glucanase）等植物病害相关蛋白，它们通过破坏病原真菌的细胞壁而起到抗菌防病作用。

Vivekananthan等（2007）研究一株从根围分离到的Pseudomonas fluorescens，除在平板上对C.gloeosporioides有62.7%的菌落生长抑制率外，还能诱导芒果组织相关防御酶的增强表达及积累，而用添加了几丁质的培养液发酵出来的培养液比不含几丁质的培养液能更明显提高芒果叶片、花、果实表皮组织中几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的积累，在果实防病试验中，处理组的病果率仅4%，相对于空白对照组减少90%。

另外，经处理过的果实在采后贮藏期炭疽病的潜伏
期也相对延长，防效的持续时间比多菌灵长。

杨胜远等（2004b）用芽孢杆菌X-98-2发酵液处理芒果果实，发现该菌株发酵液可以降低采后芒果重量损失率及推迟其后熟的保鲜作用。

研究认为病原菌最直接的营养来源是可溶性糖和游离氨基酸。

蒲金基等（2004）研究表明，芒果的淡绿色
和老叶片比古铜色嫩叶抗病，认为前者可溶性糖和游离氨基酸含量比后者少，以及前者纤维素和木质素类等物质含量高是抗性的主要原因。

因而推测芽孢杆菌X-98-2发酵液对芒果果实具有减缓其新陈代谢、降低呼吸作用和推迟后熟生理的作用，所以可以提高其抵抗病原侵入和扩展的能力而起到保鲜及延长储藏期的作用。

5 展望
探索利用拮抗细菌防治芒果炭疽病的研究在菌株筛选及防病测试上已取得一定进展，但在菌源、抑菌机理、防病机制及安全问题上仍缺乏深入、系统的研究，为促进生物防治技术的发展应用，降低现代化学农药带来的各种问题，需在以下几方面加强研究：（1）细菌在地球上广泛分布，因此拮抗细菌的来源应广泛拓取，不应仅局限在植物根围、叶围的土壤细菌和内生表生细菌，应尝试从不同生境特别是一些特殊环境的细菌中寻找筛选拮抗细菌。

（2）关于拮抗细菌的抑菌机理，目前的研究主要集中在拮抗物质的提取及其抑菌作用的测试，而关于拮抗物质对芒果炭疽菌的抑制机制及拮抗物质的合成或半合成的研究相对较少。

弄清拮抗物质的抑菌机制有利于防病手段的拓展与更新，而拮抗物质的合成可为高效安全的新药提供资源。

另外，其他如竞争和寄生等抑菌方式的研究也少见报道，可能是目前筛选的手段大多是在平板上对峙生长测试法及自然界中产生拮抗物质的细菌较多的缘故，应加大寻找力度，争取获得拮抗多样化的菌株。

（3）除了拮抗物质与组织上的病菌直接接触起到防病作用外，研究最多的是拮抗菌株的诱导防病，其中主要是几种防御酶的含量变化，但大多数情况下防御酶的含量及活性提高是短暂的，很快又会恢复原状或下降，在实际防病中所起作用不大，因此探索其刺激应答机理是必要的。

寻找新的在诱导防御中产生的抗性物质及细菌代谢物在植物中代谢成抑菌物质应是未来的研究重点。

（4）在芒果炭疽病防治研究中安全问题大多受到忽略，如引入一种新的物种可能会破坏原生态的平衡，也可能会出现新的病害，特别是可能对动物和人类健康或生命存在威胁，因此拮抗物质对非靶标生物是否安全，及其在自然中代谢和降解等问题必须受到重视。

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