高糖环境下不同浓度黄芩苷对人肾小管上皮细胞凋亡的影响

高糖环境下不同浓度黄芩苷对人肾小管上皮细胞凋亡的影响
【】目的研究在高糖环境下不同浓度黄芩苷干预对人肾小管上皮细胞凋亡的影响。

方法本研究通过体外实验，分别检测在高糖环境下不同浓度黄芩苷干预24h、48h、72h 上皮细胞增殖及凋亡情况，并同时设立阴性对照组低糖组、阳性对照组高糖组和阳性药物对照组RGZ。

结果24h、48h时间点，黄芩苷干预下的上皮细胞以促进增殖、抑制凋亡为主要表现72h时间点，低剂量黄芩苷50、100molL干预下的上皮细胞仍以促进增殖、抑制凋亡为主要表现，但高剂量黄芩苷组别200molL干预下的上皮细胞以抑制增殖、促进凋亡为主要表现。

在高糖环境下黄芩苷可抑制上皮细胞凋亡，与阳性药物对照RGZ的趋势一致。

结论黄芩苷可能通过抑制细胞凋亡的药理作用，发挥对肾脏的保护作用。

【关键词】黄芩苷人肾小管上皮细胞HK2 细胞凋亡糖尿病
【中图分类】R285.5【文献标志码】A【编】10078517201621002903
Effect of Baicalin Bai on HK2 cells Apoptosis in High GLucose Medium
SUN Tao1，2HUANG Zhujuan1SU Ning1
1.Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou ，China
2. Guangzhou Fenghua Bioengineering Co.，Ltd ，Guangzhou ， China
Abstract Objective To study the effect of Baicalin BaiBB on HK2 cells apoptosis in high glucose mediumthods The cell proliferation was detemined with MTT method at 24h，48h，72h respectively after HK2 cells were incubated with normal glucose，high glucose，high glucose plus RGZ or high glucose plus BB.Results At 24h 48h，in comparison with NG HG group，the proliferation of HK2 cells in HG+BB group was increased
insignificantly. At 72h，in comparison with NG group，the proliferation of HK2 cells in HG+BB group was increased insignificantly except for the high dose HG+BB group200molL.During the observation，the effect of BB on HK2 cells growth cultured in high glucose medium is facilitative mainly， its similar to RGZ in concentration and times.Conclusion BB pharmacological effects by inhibiting apoptosis，play a protective effect on the kidneys.
Keywords HK2 Kidney Tubules Cell Division High Glucose
糖尿病肾病[1] diabetic nephropathy，DN是以肾脏微血管病变作为最主要表现的糖尿病并发症，也是造成慢性肾衰的主要病因，发病机制尚不完全清楚。

近年来，随着研究的深入，证实细胞凋亡参与DN发生机制。

细胞凋亡是机体内细胞死亡的重要途径[2]，细胞的死亡和更新是多细胞生物整个生命过程中不可缺少的环节，可及时清除机体内的多余细胞和受损伤细胞，对各组织器官的发育及免疫系统的建立发挥重要作用。

通常情况下，细胞凋亡过程受机体内严格调控，以维持整个生命过程中各组织器官的稳定性。

但当细胞凋亡调控失衡时，可引起细胞过度增殖或
过度凋亡，都是导致糖尿病肾病患者肾功能进一步恶化的重要因素之一。

传统药物黄芩scutellaria baicalensis georgi为唇形科植物黄芩的干燥根，迄今己有2016多年的药用历史，该药在《神农本草经》中列为中品，用于诸热黄胆，肠泄痢，逐水，下血闭，恶疮疽蚀火疡。

黄芩苷baicalin bai，BB是从黄芩中提取的一种黄酮类化合物，具有抗菌、消炎、抗氧化、治疗或预防糖尿病及其并发症等药理作用[3]。

在前期研究中发现黄芩苷对糖尿病肾病大鼠肾脏具有保护作用[48]。

在此基础上，本文通过体外实验，观察在高糖环境下不同浓度的黄芩苷对人肾小管上皮细胞HK2细胞凋亡的影响。

1材料与方法
1.1主要实验材料HK2细胞株购自于中山大学实验动物中心，盐
酸罗格列酮标准品、黄芩苷标准品广东省食品药品检验所，批，DMEM 低糖和高糖培养基、胰蛋白酶上海立菲生物技术有限公司，胎牛血清FBS，浙江天杭生物科技有限公司，噻唑蓝MTT，美国sigma 公司、二甲基亚砜DMSO，美国sigma公司。

1.2细胞培养及分组HK2细胞株置于体积分数为5%CO2的37℃恒温培养箱中用含10%FBS的DMEM低糖培养基传代培养，胰蛋白酶消化细胞后，用计数板计数，按以4000孔的密度接种于96孔板，每孔加入100L 含10%FBS的低糖培养液培养24h，使细胞同步于G0期。

弃去培养液，将HK2细胞随机分为7组每组设5个复孔 A组NG DMEM 低糖培养液D葡萄糖浓度为5.5mmolL B组HG DMEM 高糖培养液D葡萄糖浓度为25mmolL C组HG+R5 DMEM 高糖培养液和RGZ终浓度为5molL D组HG+R10 DMEM 高糖培养液和RGZ终浓度为10molL E组HG+BB50 DMEM 高糖培养液和BB终浓度为50molL F组HG+BB100 DMEM 高糖培养液和BB终浓度为100molL G组HG+BB200 DMEM 高糖培养液和BB终浓度为200molL。

分别干预24、48、72h，共设3个实验观察点。

1.3 MTT比色法检测细胞增殖当实验点结束24、48、72h时，使用浓度为5mgmL的MTT 溶液加入待测孔，孵育4h，弃去废液，重新加入DMSO 150L 孔，振荡10min后，放入iMark 吸收光酶标仪选择490nm波长，BioRad 公司进行检测并记录结果OD值。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率采用AnnexinV异硫氰酸荧光素FITC碘化丙啶PI双标记染色法检测细胞凋亡情况。

按上述分组方法，以4000孔的密度将细胞培养于96孔板中，当实验点结束24、48、72 h时，用流式细胞仪检测各组肾小管上皮细胞的凋亡率Q2+Q4。

1.5统计学处理使用SPSS17软件进行统计并orgin pro 8.0绘图，数据以均数加减标准差xs表示，数据采用Bartlett球形检验方差齐性，方差齐性时多组间两两比较采用单因素方差分析Oneway ANOVA，Posthoc 检测采用 Tukey方法方差不齐时采用KruskalWallis H进行检验，以P0.05为差异有统计学意义。

2实验结果
2.1高糖环境下不同浓度黄芩苷对HK2细胞增殖的影响在24h的实验点中，B组、C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义P0.05。

F组与B组比较，差异均有统计学意义P0.05，其余组别与B组比较，差异均无统计学意义P0.05。

在48h的实验点中，B组、C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义P0.05。

B组、C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均无统计学意义P0.05。

在72h的实验点中，B组、C组、D组、E 组和F组与A组比较，差异均有统计学意义P0.05 其余组别与A组比较，差异均无统计学意义P0.05。

C组、D组和F组与B组比较，差异均有统计学意义P0.05，其余组别与B组比较，差异均无统计学意义P0.05。

结果详见表1和图1。

2.2高糖环境下不同浓度黄芩苷对HK2细胞凋亡率的影响在24h 的实验点中，C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义P0.05。

C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均有统计学意义P0.05。

在48h的实验点中， C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义P0.05。

C组、D组、E组、F 组和G组与B组比较，差异均有统计学意义P0.05。

在72h的实验点中，B组、C组、E组和与A组比较，差异均有统计学意义P0.05 D 组、F组与A组比较，差异均无统计学意义P0.05。

C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均有统计学意义P0.05。

结果详见表2。

3讨论
MTT比色法是目前检测细胞增殖的常用手段之一，其主要原理[9]是利用四甲基偶氮唑盐在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT甲肷，形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关。

在研究中观察到，在高糖环境下，HK2细胞增殖快速B组与A组比较，低、中浓度黄芩苷影响下的HK2细胞增殖快速，高浓度黄芩苷影响下的HK2细胞增殖受抑制，72h观察时间点最为显著。

提示高糖对HK2细胞产生双重效应，既能诱导细胞增殖，在高浓度药物环境下，又可抑制细胞增殖。

本实验使用的阳性对照组RGZ的HK2细胞增殖情况与既往研究的报道[10]基本一致。

流式Annexin VPI 双染法是目前比较常用、灵敏较高的细胞凋亡测定方法，其主要原理是通过Annexin VFITC和PI双重荧光标记以区分正常细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

在研究中观察到，在高糖环境下，HK2细胞凋亡显著增多B组与A组比较，结合MTT检测结果提示在高糖环境下HK2呈高增殖伴高凋亡率。

在药物包括BB、RGZ 影响下，可显著降低凋亡率。

但是高浓度黄芩苷G组在72h观察时间点的凋亡率较其他用药组别显著升高，结合MTT检测中低增殖的表现，考虑高浓度黄芩苷促进HK2细胞凋亡，抑制
HK2细胞增殖，而低、中浓度黄芩苷抑制HK2细胞凋亡、促进HK2细胞增殖。

本研究结果与前期研究结果[48]提示黄芩苷可能通过抑制细胞凋亡的药理作用，发挥对肾脏的保护作用。

参考文献
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