低频超声增强万古霉素对导管表皮葡萄球菌生物被膜影响的体内实验

低频超声增强万古霉素对导管表皮葡萄球菌生物被膜影响的体
内实验
李军帅;余加林;董莹;芦起;李禄全;耿化晓;李莎
【摘要】目的探讨低频超声联合万古霉素对表皮葡萄球菌(S.epidermidis)RP62A 生物被膜(biofilm,BF)的影响.方法建立兔表皮葡萄球菌导管感染模型,设空白对照组,单独低频超声组,单独万古霉素组,低频超声联合万古霉素组.涂板菌落形成单位(colony-forming units,CFU)计数法计算导管细菌数;扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察BF结构的改变;皮肤、心脏、肝脏及肾脏病理组织切片检查组织的炎症反应.结果单独低频超声对BF内细菌无杀灭作用,单独万古霉素能比较有效地杀灭BF内细菌,较空白对照组CFU减小,P＜0.01;低频超声联合万古霉素组效果更加明显.SEM显示低频超声对BF结构无影响;与各单独作用组相比,低频超声联合万古霉素能明显地破坏BF,使其结构变得更加疏松.皮肤病理组织切片显示低频超声联合万古霉素组,皮下隧道炎症明显减轻.结论低频超声联合万古霉素能更显著地清除导管表皮葡萄球菌BF.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2014(039)006
【总页数】4页(P466-469)
【关键词】低频超声;万古霉素;表皮葡萄球菌;生物被膜
【作者】李军帅;余加林;董莹;芦起;李禄全;耿化晓;李莎
【作者单位】重庆医科大学附属儿童医院新生儿科,儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室,重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地,儿科学重庆市重点实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院新生儿科,儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室,重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地,儿科学重庆市重点实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院新生儿科,儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室,重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地,儿科学重庆市重点实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院新生儿科,儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室,重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地,儿科学重庆市重点实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院新生儿科,儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室,重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地,儿科学重庆市重点实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院新生儿科,儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室,重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地,儿科学重庆市重点实验室,重庆400014;重庆医科大学附属第一医院,重庆400010
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1
当今，随着医疗技术的提高，植入性医疗器械，如中心静脉导管、外周置入中心静脉导管、气管插管等广泛地应用，以生物材料为中心的感染成为令人棘手的医院内感染。

表皮葡萄球菌(S. epidermidis)作为医院内感染常见致病菌，常伴随生物材料进入体内，黏附其表面形成生物被膜(biofilm, BF)，从而使BF内的细菌有效抵抗抗菌药物的治疗[1-2]，使得对游离菌致死剂量的抗菌药物往往难以透过BF的基质及菌丛紧密的组织结构而彻底清除细菌，导致临床感染的顽固性和难治性，使BF治疗更为棘手。

新生儿常需接受植入性医疗器械辅助治疗，由于其免疫系统功
能极不成熟，使得新生儿表皮葡萄球菌导管相关性感染问题日益突出[3]。

目前国内外对BF的研究多集中于抗生素单独或者联合治疗[4]，但有时需较大的浓度才能起到清除作用，且超声与抗生素的联合应用也多集中在体外。

本实验建立家兔皮下表皮葡萄球菌导管相关性感染的模型，探索低频超声联合万古霉素对表皮葡萄球菌BF的影响。

1.1 实验菌株
表皮葡萄球菌RP62A菌株(复旦大学高谦教授赠，本实验室保存)。

1.2 实验动物
新西兰大白兔，(2.5±0.2)kg/只，雌雄不限，购于重庆医科大学动物中心。

1.3 实验试剂
万古霉素(日本Lilly公司，进口药品注册证号：H20080356)，Tryptone soy broth(TSB，胰蛋白胨大豆肉汤，Solarbio公司)。

1.4 实验器材
导管(美国IL公司，特氟龙，内径1.6mm，外径2.0mm)，低频超声仪(重庆医科大学超声影像学研究所)，扫描电镜(日立S-3400N)，紫外分光光度计UV-70(苏州岛津仪器有限公司)，组织脱水仪(常州中威电子仪器)，石蜡组织切片机(LEICA-2065，常州中威电子仪器)，常规手术器械。

2.1 体外模型构建
挑取表皮葡萄球菌RP62A单菌落接种于TSB培养液中，37℃，180r/min振荡培养过夜。

分光光度计测定菌液A600值，调整A600值为1.5×108CFU/mL，TSB 液稀释100倍后作为最终接种菌液。

将导管截成每段2cm，接种100μL菌液于灭菌的导管内，37℃培养24h得到成熟生物膜[5]。

2.2 超声仪器参数
频率为300kHz，声强为0.5w/cm2的脉冲波，50%的工作周期，超声探头末端
涂抹耦合剂，放于兔背部置管皮肤表面辐射。

2.3 动物模型的制备
2.3.1 动物模型建立
10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉兔，剪去背部皮肤兔毛，聚维酮碘、75%酒
精消毒。

背部皮肤行皮下隧道，将长有BF的导管放入，手术线缝合。

2.3.2 动物分组及干预
16只健康新西兰大白兔随机分为4组。

空白对照组，单独低频超声组，单组万古霉素组及低频超声联合万古霉素组。

分别在术前、术后24h、48h及72h，未行
干预之前取耳缘静脉血涂板培养。

干预方式如表1，其中低频超声作用时间为
5min，万古霉素为耳缘静脉注射5mg/kg。

2.4 导管菌落计数
术后72h空气栓塞处死兔，取出导管，纵切分开一半用灭菌生理盐水冲洗后置于
2mL TSB培养基中，超声震荡后涡旋仪混匀，等倍稀释取50μL平铺于TSB琼脂
平板上，37℃孵育过夜后计数平板上菌落数。

2.5 扫描电镜(SEM)观察导管表皮葡萄球菌BF形态
纵切分半导管用磷酸盐缓冲液反复漂洗，去除游离细菌，2.5%戊二醛缓冲液固定
2h后，再用灭菌PBS冲洗2次，30%～100%浓度乙醇系列脱水后，经50%～100%叔丁醇置换，干燥，离子溅射仪喷金，通过SEM观察表葡菌BF形态。

2.6 皮肤、心脏、肝脏及肾脏病理组织切片
分别取置管周围的皮肤组织、心脏、肝脏及肾脏组织，4%中性缓冲甲醛溶液固定48h，脱水、包埋、切片，苏木精-伊红(HE)染色。

光学显微镜观察组织病理切片。

2.7 数据统计学分析
采用SPSS11.5软件对所有数据结果进行统计，计量资料以均数±标准差(x_± s)表示，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。

P＜0.05为差异有统计学意义。

3.1 各组导管菌落计数结果(表2)
单独超声组与空白对照组相比无显著差异；单独万古霉素组、低频超声+万古霉素组与空白对照组相比有明显差异，P＜0.01；且低频超声+万古霉素组与单独万古霉素组相比，P＜0.01。

3.2 SEM观察表皮葡萄球菌BF形态(图1)
经过各组干预后表皮葡萄球菌BF的SEM见图1。

从图中可以看出，空白对照组BF细菌相互紧密连接，且菌外由大量的纤维样物质包裹成团状(图1a)；单独低频超声组未见变化(图1b)；单独万古霉素组BF密度稍有降低，细菌数量较空白对照组减少(图1c)；低频超声联合万古霉素组可见BF结构明显变得简单、疏松，仅可见少许散在的细菌团和单个细菌，表示低频超声联合万古霉素能有效的杀灭BF内细菌，破坏BF结构(图1d)。

3.3 皮肤组织病理切片HE染色
由HE染色图片可以看出：空白对照组与单独超声组的皮下隧道炎症非常明显，由大量的炎症细胞组成，且大量侵入相邻皮下疏松结缔组织及肌肉层(图2e)；与空白对照组及各单独作用组相比，低频超声+万古霉素组皮下隧道炎症明显减轻，说明两者联合作用下，能明显地杀灭BF内细菌(图2i)。

3.4 兔耳缘静脉血培养
结果未见有细菌生长，心脏、肝脏及肾脏病理组织切片与正常组织相比未见异常。

BF是一个具有协调性、结构性和功能性的高度组织群体，具有BF的细菌其生物特性与浮游菌显著不同，适应环境能力更强，不仅能抵抗吞噬细胞作用，还可逃避宿主免疫。

当细菌形成BF后，由于其渗透限制作用，及其内细菌所处的微环境改变等原因，内部细菌对抗生素的耐药性比浮游菌要增加10～1000倍[6]，抗生素应用不能有效清除BF，还可诱导耐药性产生，其引发的感染通常只有移除植入物才能得到控制。

超声作为一种廉价的无创技术，能够集中透过皮肤和组织，实现较
好的靶向及治疗作用，已安全地用于影像学及临床治疗等方面。

大量的研究证实低频超声具有药物促渗作用，能够增强药物对BF的破坏[7-8]。

低频超声(＜500kHz)组织穿透性较好，不会随着穿透的增加出现明显的能量衰减，因此可到达较深层部位的组织；且在声强相同的情况下，低频超声在相同深度下产生的热量要低于高频超声(＞1MHz)[9]，从而降低了对周围组织的潜在损伤。

本课题组前期体外试验已证实低频超声能够增强万古霉素对表皮葡萄球菌BF的破坏及灭菌作用[10]，为进一步证实体内是否有效果，本实验建立兔皮下表皮葡萄球菌导管感染模型，利用低频超声联合万古霉素对BF进行干预。

从SEM图片我们
可以看到，与空白对照组相比，低频超声联合万古霉素组BF结构的破坏及灭菌作用非常明显，仅可见少许散在的细菌团及单个细菌；导管菌落计数结果显示单独万古霉素组与空白对照组相比有明显的差异(P＜0.01)；与单独各组相比，低频超声
联合万古霉素组差异更加显著，进一步提示低频超声与万古霉素有协同作用，能够增强万古霉素对细菌的杀灭作用。

多数学者认为，低频超声增强药物对生物被膜破坏及杀菌能力可能主要与超声的稳态空化效应有关。

稳态空化即超声在低强度时，压缩阶段的微泡体积逐渐缩小，但不发生破裂。

微泡绕其平衡半径振动，从而产生微射流和剪切力，两者共同作用可促进小分子物质穿透界膜和细胞膜[11]。

空化效应可能会导致细菌生物被膜产生“临时通道”，药物能够持续通过该通道进入生物被膜内而增强杀菌作用；而超声辐射一旦停止，“临时通道”迅速闭合，生物被膜又可恢复至原来状态。

生物被膜中的细菌处于厌氧及营养物质匮乏的环境中，低代谢状态的细菌耐药性更强，在此过程中也可能会伴随着对氧气和其他小分子的运输增加，同时加快代谢产物的排除，改变新陈代谢状态，使得细菌对药物更加的敏感，从而大大地增加了药物对细菌的杀灭作用[12]。

由皮肤病理图片我们可以看出，低频超声联合万古霉能够明显减轻皮下隧道的炎症反应，大大地降低对皮肤组织的损伤。

且低频超声辐射对皮肤、心脏、肝脏及肾脏组织未发现损害，说明了低频超声
应用具有一定的安全性。

Carmen[9]等曾利用聚合物片作为表皮葡萄球菌BF载体植入皮下，低频超声联合万古霉素进行干预，证实了低频超声能够增强万古霉素对BF的清除及灭菌作用。

本实验利用导管作为BF载体，从而更接近于临床，是临床应用低频超声联合抗生素治疗导管生物被膜感染的前期工作。

本实验通过建立兔皮下表皮葡萄球菌导管感染模型，证实了低频超声能够增强万古霉素对导管表皮葡萄球菌BF的清除及杀菌作用，为临床治疗导管感染提供了新的依据，同时为低频超声在临床的应用提供了新的方向。

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