超声波对酪蛋白结构与功能性质的影响

超声波对酪蛋白结构与功能性质的影响
石燕;葛辉;涂宗财;王辉
【摘要】为了探讨超声波对酪蛋白结构与功能性质的影响,研究了酪蛋白溶液经过超声波处理后溶解度、起泡性、乳化性、粒度、二级结构、分子柔顺性和分子质量的变化规律.结果表明:随着超声波功率的增大及处理时间的延长,酪蛋白的溶解度逐渐增大.480 W下起泡性、960 W下乳化性最高,分别比未处理的提高了17.03％和31.78％；固定功率240W,处理时间为25 min的起泡性、15 min的乳化性最高,分别比未处理的提高了22.65％和18.88％.适当条件的超声波处理能使酪蛋白溶液粒度减小且分散均匀,同时还能显著提高酪蛋白分子柔顺性、降低酪蛋白的α-螺旋含量,240W超声处理15 min后,α-螺旋含量降低了4.80％.但超声波处理不会使酪蛋白分子质量发生明显变化,不会导致其肽键断裂.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2014(040)002
【总页数】6页(P16-21)
【关键词】超声波处理;酪蛋白;功能性质;二级结构;分子柔顺性
【作者】石燕;葛辉;涂宗财;王辉
【作者单位】南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学食品科学与工程系,江西南昌,330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学食品科学与工程系,江西南昌,330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学食品科学与工程系,江西南昌,330047;江西师范大学功能有机小分子教育部重点实验
室,江西南昌,330022;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学食品科学
与工程系,江西南昌,330047
【正文语种】中文
酪蛋白是牛奶中的主要蛋白，约占总蛋白的80%［1］，它不仅是一种优良蛋白质，而且还是百余种活性多肽的有效肽源，功能涵盖免疫调节、清除自由基、抑菌、抗癌等［2］。

但酪蛋白在中性及弱酸性条件下溶解度很低，限制了其功能性质的发挥，急需通过改性来拓宽其应用范围。

众学者采用热处理［3］、酶水解［4］、
高压均质［5］和超声处理［6］等方法对蛋白质进行改性。

相比于其他方法，超
声波具有改性效果显著、不损失营养物质、无毒无害等优点，已用于改善乳清蛋白的溶解性和起泡性［7］，提高花生蛋白的乳化性［8］以及增强大豆分离蛋白的
凝胶特性［9］等。

超声波是指频率大于20kHz的声波，可分为高频率低强度超声波和低频率高强度
超声波［10］。

低强度超声波常用于分析食品硬度、成熟度、糖含量和酸度等理
化指标，而高强度超声波则常用于改变食品的理化特性［10］。

本文研究了超声
波处理对酪蛋白溶解性、起泡性和起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性等功能性质的影响，分析超声波处理后酪蛋白溶液的粒度、分子柔顺性、二级结构及其分子质量的变化，以此来探究超声波处理后酪蛋白功能性质与其结构变化的关系。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
酪朊酸钠、8-苯胺-1-萘磺酸、β-巯基乙醇，Sigma公司;牛血清白蛋白标准品、胰蛋白酶(1∶250)、福林酚试剂、170 kDa Maker，北京索莱宝科技有限公司;大豆油，中粮集团;其他试剂为分析纯。

JY98-ⅢDN超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技公司;NICOMPTM 380激光纳米粒度测定仪，美国Nicomp公司;UV-3200紫外-可见分光光度计，上海美谱达公司;T25-高速分散机，德国 IKA公司;MOS-450/AF-CD圆二色光谱仪，法国Bio-Logic公司;MTB电泳仪，美国Bio-Rad Laboratories公司;KDY-9820型凯氏定氮仪，北京通润源机电公司;Anke TGL-16C离心机，上海安亭实验仪器厂;THZ-82A水浴恒温振荡器，金坛市精达仪器厂。

1.2 实验方法
1.2.1 蛋白溶液的制备
将酪朊酸钠用水配成质量浓度为0.5 g/100 mL的溶液，取500 mL 蛋白溶液分别于 0、120、240、480、720、960 W的超声波下处理5 min。

另取500 mL在240 W 超声波下分别处理 0、5、10、15、20、25 min。

1.2.2 粒度的测定
参考涂宗财等人［11］的方法，采用纳米激光粒度仪测定酪蛋白溶液的粒度，由仪器自带的CW388软件计算蛋白的平均粒度和粒度分布变异系数。

1.2.3 溶解度的测定
将超声波处理过的酪蛋白溶液用1 mol/L NaOH及HCl溶液调pH至7.0，10 000 r/min离心15 min，上清液用双缩脲法［12］测定可溶性蛋白含量，蛋白质总量采用凯氏定氮法测定。

蛋白质溶解度计算:
1.2.4 起泡能力的测定
参考 Yin［13］的方法，取10 mL 0.5 g/100 mL 超声波处理过的酪蛋白溶液用水稀释至质量浓度为0.25 g/100 mL，9 500r/min分散2min，记录泡沫体积V0，静置30 min，记录泡沫体积V30。

1.2.5 乳化能力的测定
参考 Krasaechol N［14］的方法，取12 mL 0.5 g/100 mL超声波处理过的蛋白溶液与4 mL大豆油混合，13 500 r/min乳化2 min，立即从烧杯底部取50 μL
乳状液与5 mL 0.1g/100 mL SDS溶液混合，500 nm下测吸光度A0，静置30 min后按相同方法测定乳状液的吸光度A30。

式中:T=2.303;乳化性(EA)，m2/g;乳化稳定性(ES)，min;N为稀释倍数;c为乳状
液形成前蛋白质量浓度，g/mL;φ为乳状液中油的体积分数。

1.2.6 圆二光谱分析二级结构变化
MOS-450/AF-CD圆二色光谱仪(法国Bio-Logic公司)测定酪蛋白溶液的近紫外
圆二光谱变化。

将超声波处理后的酪蛋白溶液注入0.l cm厚的椭圆形比色皿中，
在25℃和连续充氮的条件下，进行近紫外区域(190～250 nm)扫描，速度为50 nm/min，光谱间隔0.l nm，3次累积。

通过在线软件分析得到酪蛋白二级结构的具体组成。

1.2.7 蛋白质分子柔顺性的测定
参考Kato［15］的方法，以胰蛋白酶酶解蛋白质的速率来判断蛋白分子柔顺性。

1 mg/mL的蛋白质溶液(溶剂为0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液，pH 8.0)于38℃恒
温水浴摇床(振动频率为100 r/min)中恒温，按蛋白质与酶质量比16∶1添加胰蛋白酶，分别在第1、2、5、10、15 min取4 mL 酶解液与4 mL 4g/100 mL 的三氯乙酸溶液混合，8 000 r/min离心10 min。

上清液中的多肽与氨基酸含量可以
用Lowry法［16］测得。

100%消化是指酶解反应1 h后，90℃加热10 min酶
解液中多肽与氨基酸含量。

1.2.8 SDS-PAGE分析蛋白质分子质量的变化
电泳条件:5%浓缩胶，12%分离胶，4倍上样缓冲液，上样量8 μL，电流12 mA，
Mark为低分子质量(170 kDa)。

用考马斯亮蓝G250染色45 min后脱色。

2 结果与讨论
2.1 超声波对酪蛋白粒度的影响
不同超声功率下酪蛋白平均粒度的变化如图1(a)所示。

随着超声功率的提高，酪
蛋白的平均粒度先减小后增大，粒度减小是由于在超声波的机械剪切力作用下，蛋白颗粒被粉碎，从而使溶液粒度变小［17］，而当超声功率达到一定数值时，由
于输入的能量过高，破坏了蛋白颗粒表面静电平衡，部分被击碎的蛋白颗粒可能会聚合使颗粒变大［11，18］。

固定粒度最小时的超声功率240 W，改变超声时间，从图1(b)知，酪蛋白的平均粒度随超声时间的增加而减小。

图1 超声波功率(a)和时间(b)对酪蛋白平均粒度的影响Fig.1 Effects of ultrasound treatment power(a)and time(b)on the mean particle diameters
of casein
超声波处理前后酪蛋白溶液的粒度分布变异系数(表1)表明:除480 W处理5 min
的样品外，超声波处理后的酪蛋白溶液的粒度分布变异系数均比未经超声处理的小，说明酪蛋白经超声波处理后颗粒分布更加均匀。

表1 不同超声波功率和时间对酪蛋白粒度分布变异系数的影响Table 1 Particle distribution’s variance of 0.5 g/100 mL casein under different power or time of ultrasound treatment注:实验结果以平均值±标准偏差表示(n=3)，同列不同字母代表具有显著性差异(P＜0.05)。

处理时间处理功率5 min功率/W 变
异系数(P.I.)240 W时间/min 变异系数(P.I.)0 0.324±0.031b 0 0.324±0.031a 120 0.274±0.022bc 5 0.257±0.015b 240 0.257±0.015c 10 0.240±0.030b 480 0.399±0.040a 15 0.277±0.019b 720 0.266±0.033c 20 0.251±0.024b 960 0.198±0.027d 25 0.276±0.028b
2.2 超声波对酪蛋白溶解度的影响
不同超声波条件下的酪蛋白溶解度如图2所示。

随着超声波功率的增加，酪蛋白
溶解度逐渐增加［图2(a)］。

大于240 W超声处理后酪蛋白溶解度变化趋于平缓，选择超声功率240 W，改变超声时间，酪蛋白的溶解度在15 min内有较快的增长，之后趋于平缓［图2(b)］。

其可能的原因是，超声波的机械剪切力使得蛋白
质粒度变小，增大了蛋白颗粒与水的接触面，其溶解度增大［7，19］;同时，在超声波处理过程中，探头周围空化作用产生的局部高温高压可以使蛋白质分子展开，亲水性氨基酸残基暴露，致使酪蛋白溶解度提高［20］。

图2 超声波功率(a)和时间(b)对酪蛋白溶解度的影响Fig.2 Effects of ultrasound treatment power(a)and time(b)on the solubility of casein in pH 7.0
2.3 超声波对酪蛋白起泡性和起泡稳定性的影响
酪蛋白分子是由亲水性氨基酸和疏水性氨基酸所构成的嵌段型共聚物，具有较强的表面活性，能降低水的表面张力，在剧烈搅拌过程中形成泡沫。

不同超声波条件下酪蛋白的起泡性和起泡稳定性如图3所示。

图3 超声波功率(a)和时间(b)对酪蛋白的起泡性和起泡稳定性的影响Fig.3 Effect of ultrasound treatment power(a)and time(b)on the foaming capacity and foaming stability of casein
从图3(a)可以看出，随着超声波功率的提高，酪蛋白的起泡性先增大后减小，当
超声波功率为480 W时，酪蛋白的起泡性达到最大值，比未处理的提高了
17.03%;而酪蛋白的起泡稳定性随功率的提高而逐渐增大。

结合2.1、2.2实验结果，选择功率240 W，改变超声波处理时间。

酪蛋白的起泡性与起泡稳定性随超
声波处理时间的延长均有逐渐增大的趋势［图3(b)］，酪蛋白溶液经过240 W超声波处理25 min后其起泡性比未处理的提高了22.65%。

酪蛋白起泡性与起泡稳
定性的提高可能与超声波的均质作用有关。

超声波的机械均质可以减小蛋白的粒度并使其分散得更均匀，增加了其起泡性和起泡稳定性，同时超声波处理可以使蛋白
质部分结构展开，这也可能增加了酪蛋白的起泡性与泡沫稳定性［7］。

2.4 超声波对酪蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
超声波处理对酪蛋白乳化性和乳化稳定性的影响如图4所示。

从图4(a)看出，随
着超声波功率的增加，酪蛋白的乳化性逐渐提高，960 W时，酪蛋白的乳化性比
未处理的提高了31.78%。

结合之前的实验结果，选择功率240 W，改变超声波
处理时间。

随着超声波处理时间的延长，酪蛋白的乳化性先增大后减小，超声处理15 min时达最大值，比未处理的增加了18.88%［图4(b)］。

然而，酪蛋白的乳
化稳定性在不同条件的超声波处理下并无显著性变化(图4)。

蛋白质的乳化性能与
其分子的柔顺性有关，蛋白的柔顺性越高，其乳化活性越好［6］。

超声波处理使酪蛋白的粒度变小，蛋白分子部分展开，柔顺性增大，提高了蛋白的乳化性［20］。

当处理时间超过一定值时，展开的蛋白质分子会通过氢键和二硫键等作
用力重新形成聚合体，分子柔顺性降低，因此乳化性下降［21］。

图4 超声波功率(a)和时间(b)对酪蛋白的乳化性和乳化稳定性的影响Fig.4 Effect of ultrasound treatment power(a)and time(b)on the emulsifying activity and emulsifying stability of casein
2.5 超声波对酪蛋白二级结构的影响
通过在线软件分析得到酪蛋白二级结构的具体组成，见表2。

酪蛋白经过不同条件的超声波处理后，酪蛋白β-折叠和β-转角含量均未发生显著性变化，α-螺旋含量显著性降低(P＜0.05)，而无规则卷曲含量相比于未处理样品均有不同程度的增加。

其中，经过240 W超声波处理15 min后的酪蛋白α-螺旋减少最大，降低了
4.80%，而240 W超声波处理20 min后的酪蛋白无规则卷曲含量高达41.00%。

这可能是由于超声波空化作用产生的局部高温使酪蛋白α-螺旋含量减少［22］。

超声波处理能使酪蛋白分子中的螺旋结构部分展开，蛋白质分子柔顺性增加。

这也可能是酪蛋白某些功能性质(如起泡性，乳化性等)改善的内在因素。

表2 超声波处理后酪蛋白二级结构的变化Table 2 Change of the second structure of casein by ultrasound treatment注:实验结果以平均值±标准偏差表示(n=3)，同列不同字母代表具有显著性差异(P＜0.05)。

蛋白样品二级结构组成转角无规则卷曲未处理12.83±1.39a 23.75±1.58a 28.66±1.98a
34.76±3.67/%α-螺旋β-折叠βa 120 W、5 min 9.84±1.03bcd 24.21±2.97a 29.28±2.76a 36.67±4.14a 240 W、5 min 10.34±1.08bc 23.55±2.50a 29.09±2.42a 37.02±2.73a 480 W、5 min 10.17±1.29ab 24.39±1.89a
28.31±2.39a 37.13±3.22a 720 W、5 min 9.69±0.71bcd 24.74±2.63a
29.36±2.93a 36.21±3.20a 960 W、5 min 8.78±0.98cd 25.01±2.14a
27.38±2.23a 38.83±2.81a 240 W、10 min 9.24±1.03cd 25.23±2.36a 27.18±1.64a 38.35±3.46a 240 W、15 min 8.03±0.78d 24.56±1.65a
27.92±2.02a 39.49±2.72a 240 W、20 min 8.32±0.63d 23.44±2.27a
27.24±1.74a 41.00±3.78a 240 W、25 min 8.15±0.67d 22.80±2.29a
28.87±3.37a 40.18±3.72a
2.6 超声波对酪蛋白分子柔顺性的影响
柔性蛋白比刚性蛋白更易被肠道蛋白酶消化，因此可以利用蛋白质的酶解速率高低来表示蛋白质的柔顺性大小，蛋白柔性越大越容易被酶解［15］。

图5为超声波处理酪蛋白后的胰蛋白酶酶解图。

从图中可以看出，超声波处理后的酪蛋白酶解速率显著高于未处理的酪蛋白，即超声波处理可以显著提高酪蛋白的分子柔性。

这与前面的实验结果是相吻合的。

图5 不同超声波功率(a)和时间(b)处理后酪蛋白的胰蛋白酶解曲线图Fig.5 Time course of proteolytic digestion with trypsin of casein by ultrasound treatment
2.7 超声波对酪蛋白分子质量的影响
超声波处理对酪蛋白分子质量的影响如图6所示。

不同条件超声波处理下酪蛋白
溶液的凝胶色谱条带间不存在显著差异。

由此可得出0～960 W超声波处理5
min和240 W超声波处理0～25 min，蛋白质分子质量没有发生显著变化，不会导致酪蛋白分子肽键的断裂。

这与 Zhang［8］和 Hu［23］得到的超声波处理后花生分离蛋白和大豆分离蛋白的电泳图相似。

图6 超声波处理后酪蛋白聚丙烯凝胶电泳图Fig.6 SDS-PAGE of casein after ultrasound treatment
3 结论
随着超声波功率的增大及处理时间的延长，酪蛋白的溶解度逐渐增大。

在480 W
的起泡性、960 W的乳化性最高，分别比未处理的提高了17.03%和31.78%;固
定功率240 W，处理时间为25 min的起泡性、15 min的乳化性最高，分别比未处理的提高了22.65%和18.88%。

超声波处理能使蛋白质结构发生一定的变化。

适当条件的超声波处理能够使酪蛋白粒度变小且分散均匀，并能有效提高其分子柔性。

超声波处理会使酪蛋白的α-螺
旋含量显著降低，但不会导致酪蛋白分子肽键的断裂。

超声波处理后酪蛋白的α-
螺旋含量的减少，无规则卷曲含量的增加以及其分子柔顺性的增加，应是其功能性质(如起泡性、乳化性等)改善的原因之一。

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