诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110221043.2
(22)申请日 2021.02.26
(71)申请人 澳门大学
地址 中国澳门氹仔大学大马路澳门大学
(72)发明人 陈国凯　孟雅　
(74)专利代理机构 成都超凡明远知识产权代理
有限公司 51258
代理人 王晖　刘书芝
(51)Int.Cl.
C12N 5/077(2010.01)
A61K 35/34(2015.01)
(54)发明名称
诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细
胞传代与纯化的方法及药剂
(57)摘要
本发明公开了一种诱导干细胞往心肌细胞
方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂，
属于人多能干细胞向心肌细胞分化调控及维持
技术领域。

该诱导干细胞往心肌细胞方向分化的
方法包括：将人多能干细胞置于含烟酰胺的第一
培养基中培养，第一培养基为E5培养基。

心肌细
胞的传代方法包括：将心肌细胞置于含烟酰胺的
第二培养基中培养，第二培养基为E6培养基。

心
肌细胞的纯化方法包括：将传代处理后的心肌细
胞置于含烟酰胺的第三培养基中培养，第三培养
基为E6培养基。

上述方法能够为人多能干细胞来
源的心肌细胞的产生和传代培养提供有效可行
的新方法，且效率稳定，费用较低，利于大规模生
产。

相应的药剂应用前景较广。

权利要求书2页 说明书10页 附图5页CN 112813023 A 2021.05.18
C N 112813023
A
1.一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：将人多能干细胞置于含烟酰胺的第一培养基中培养，所述第一培养基为E5培养基；
优选地，所述烟酰胺在所述第一培养基中的浓度不低于10mmol/L；
优选地，所述烟酰胺对所述人多能干细胞的作用时间为4‑6天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先将所述人多能干细胞向中胚层分化，再加入所述烟酰胺诱导向心肌方向分化；
优选地，通过打开Wnt/β‑catenin通路诱导所述人多能干细胞向中胚层分化；
优选地，采用GSK3β抑制剂CHIR99021打开所述Wnt/β‑catenin通路；
优选地，向中胚层分化是以细胞密度为60‑80％的人多能干细胞进行；
优选地，向中胚层分化过程所用的培养基为不含TGFβ、FGF2以及胰岛素但含脂质浓缩物的E5培养基。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括在用含所述烟酰胺的所述第一培养基培养后，用含胰岛素的E5培养基继续培养分化。

4.一种心肌细胞的传代方法，其特征在于，包括以下步骤：将心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中培养，所述第二培养基为E6培养基；
优选地，所述烟酰胺在所述第二培养基中的浓度不低于10mmol/L；
优选地，所述心肌细胞为经权利要求1‑3任一项所述的诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法得到的心肌细胞；
优选地，所述心肌细胞为人多能干细胞往心肌细胞方向分化后第10‑15天的心肌细胞；
优选地，所述心肌细胞为人多能干细胞经IWP‑2或烟酰胺诱导的心肌细胞；
优选地，所述烟酰胺通过抑制ROCK通路促进所述心肌细胞存活。

5.根据权利要求4所述的传代方法，其特征在于，将消化成单细胞后的心肌细胞置于含烟酰胺的所述第二培养基中，培养1‑2天后换成不含烟酰胺的第二培养基继续培养；
优选地，采用TrypLE进行消化处理，随后用牛血清白蛋白中和反应，固液分离，将除去消化液后的呈单细胞状态的所述心肌细胞置于含烟酰胺的所述第二培养基中。

6.一种心肌细胞的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将传代处理后的心肌细胞置于含烟酰胺的第三培养基中培养，所述第三培养基为E6培养基；
优选地，所述烟酰胺在所述第三培养基中的浓度不低于10mmol/L；
优选地，传代处理的方法为权利要求4或5所述的传代方法。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，传代以1:3‑1:4的比例进行；
优选地，传代过程中加有ROCK抑制剂或烟酰胺；
优选地，所述ROCK抑制剂为Y27632；
优选地，所述ROCK抑制剂的添加浓度为5‑20μmmol/L，所述烟酰胺的添加浓度为10‑20mmol/L；
优选地，所述心肌细胞在含烟酰胺的所述第三培养基中培养4‑6天，每2‑3天更换一次新的含烟酰胺的第三培养基。

8.一种药剂，其特征在于，所述药剂含有经如权利要求1‑3任一项所述的诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法得到的心肌细胞。

9.一种药剂，其特征在于，药剂含有经如权利要求4或5所述的心肌细胞的传代方法得
到的心肌细胞。

10.一种药剂，其特征在于，药剂含有经如权利要求6或7所述的心肌细胞的纯化方法得到的心肌细胞。

诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方
法及药剂
技术领域
[0001]本发明涉及人多能干细胞向心肌细胞分化调控及维持技术领域，具体而言，涉及一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂。

背景技术
[0002]人类多能干细胞(hPSCs)可以分化为我们体内的所有细胞类型，是研究人类胚胎发育的重要模型系统。

通过hPSC分化产生的特定细胞类型在细胞治疗，药物筛选和疾病模型研究中有极大的作用。

心肌细胞具有不可再生性，因此由hPSC分化产生的心肌细胞为心脏疾病的再生修复以及药物筛选提供了材料。

目前常用的小分子抑制剂诱导心肌细胞的方法效率不稳定，并且费用较高，不利于大规模生产。

[0003]此外，如何培养和维持hPSC诱导分化的心肌细胞，仍存在诸多困难。

例如hPSC诱导分化的心肌细胞很难传代，细胞存活率低。

并且长期培养会降低心肌细胞的纯度，不利于心肌细胞用于再生修复以及药物筛选。

因此开发经济有效的分化方法，以及后续的心肌细胞传代和维持心肌细胞的纯度，对于其应用具有重大意义。

[0004]鉴于此，特提出本发明。

发明内容
[0005]本发明的目的之一包括提供一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法。

[0006]本发明的目的之二包括提供一种心肌细胞的传代方法。

[0007]本发明的目的之三包括提供一种心肌细胞的纯化方法。

[0008]本发明的目的之四包括提供一种含有经上述方法得到的心肌细胞的药剂。

[0009]本申请可这样实现：
[0010]第一方面，本申请提供一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法，包括以下步骤：将人多能干细胞置于含烟酰胺的第一培养基中培养，第一培养基为E5培养基。

[0011]在可选的实施方式中，烟酰胺在第一培养基中的浓度不低于10mmol/L。

[0012]在可选的实施方式中，烟酰胺对人多能干细胞的作用时间为4‑6天。

[0013]在可选的实施方式中，先将人多能干细胞向中胚层分化，再加入烟酰胺诱导向心肌方向分化。

[0014]在可选的实施方式中，通过打开Wnt/β‑catenin通路诱导人多能干细胞向中胚层分化。

[0015]在可选的实施方式中，采用GSK3β抑制剂CHIR99021打开Wnt/β‑catenin通路。

[0016]在可选的实施方式中，向中胚层分化是以细胞密度为60‑80％的人多能干细胞进行。

[0017]在可选的实施方式中，向中胚层分化过程所用的培养基为不含TGFβ、FGF2以及胰岛素但含脂质浓缩物的E5培养基。

[0018]在可选的实施方式中，还包括在用含烟酰胺的第一培养基培养后，用含胰岛素的E5培养基继续培养分化。

[0019]第二方面，本申请提供一种心肌细胞的传代方法，包括以下步骤：将心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中培养，第二培养基为E6培养基。

[0020]在可选的实施方式中，烟酰胺在第二培养基中的浓度不低于10mmol/L。

[0021]在可选的实施方式中，心肌细胞为经上述诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法得到的心肌细胞。

[0022]在可选的实施方式中，心肌细胞为人多能干细胞往心肌细胞方向分化后第10‑15天的心肌细胞。

[0023]在可选的实施方式中，心肌细胞为人多能干细胞经IWP‑2或烟酰胺诱导的心肌细胞。

[0024]在可选的实施方式中，烟酰胺通过抑制ROCK通路促进心肌细胞存活。

[0025]在可选的实施方式中，将消化成单细胞后的心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中，培养1‑2天后换成不含烟酰胺的第二培养基继续培养。

[0026]在可选的实施方式中，采用TrypLE进行消化处理，随后用牛血清白蛋白中和反应，固液分离，将除去消化液后的呈单细胞状态的心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中。

[0027]第三方面，本申请提供一种心肌细胞的纯化方法，包括以下步骤：将传代处理后的心肌细胞置于含烟酰胺的第三培养基中培养，第三培养基为E6培养基。

[0028]在可选的实施方式中，烟酰胺在第三培养基中的浓度不低于10mmol/L。

[0029]在可选的实施方式中，传代处理的方法为上述传代方法。

[0030]在可选的实施方式中，传代以1:3‑1:4的比例进行。

[0031]在可选的实施方式中，传代过程中加有ROCK抑制剂或烟酰胺。

[0032]在可选的实施方式中，ROCK抑制剂为Y27632。

[0033]在可选的实施方式中，ROCK抑制剂的添加浓度为5‑20μmmol/L，烟酰胺的添加浓度为10‑20mmol/L。

[0034]在可选的实施方式中，心肌细胞在含烟酰胺的第三培养基中培养4‑6天，每2‑3天更换一次新的含烟酰胺的第三培养基。

[0035]第四方面，本申请提供一种药剂，其含有经上述诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法得到的心肌细胞。

[0036]第五方面，本申请提供一种药剂，其含有经上述心肌细胞的传代方法得到的心肌细胞。

[0037]第六方面，本申请提供一种药剂，其含有经上述心肌细胞的纯化方法得到的心肌细胞。

[0038]本申请的有益效果包括：
[0039]本申请提供的诱导干细胞往心肌细胞方向分化以及心肌细胞传代与纯化的方法能够为人多能干细胞来源的心肌细胞的产生和传代培养提供有效可行的新方法，且效率稳定，费用较低，利于大规模生产。

由上述得到心肌细胞存活率及纯度较高，含有经上述方法得到的心肌细胞的药剂应用前景较广，可为心脏疾病的再生修复以及药物筛选提供材料。

附图说明
[0040]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0041]图1为不同浓度和不同时间的烟酰胺处理对hPSC H1细胞向心肌方向分化的影响图；
[0042]图2为烟酰胺诱导H1细胞向心肌细胞方向分化图；
[0043]图3为心肌细胞的细胞骨架和电生理功能分析；
[0044]图4为烟酰胺诱导hPSC H9细胞和iPSC NL4向心肌方向分化图；
[0045]图5为烟酰胺促进心肌细胞传代后存活图；
[0046]图6为烟酰胺促进烟酰胺诱导分化的心肌细胞传代后存活图；
[0047]图7为烟酰胺提高心肌细胞的纯度图。

具体实施方式
[0048]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0049]下面对本申请提供的诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂进行具体说明。

[0050]本申请提出一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法，包括以下步骤：将人多能干细胞置于含烟酰胺的第一培养基中培养，第一培养基为E5培养基。

[0051]其中，人多能干细胞(hPSC)包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞。

[0052]可参考地，不含烟酰胺的普通E5培养基的组成可以为：DMEM/F12，全转铁蛋白(holo‑transferrin)10μg/mL，亚硒酸钠(sodium selenite)14ng/mL，抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐(L‑Ascorbic acid 2‑phosphate sesquimagnesium salt hydrate)64μg/mL以及脂质浓缩物(chemically defined lipid concentrate)，其中，脂质浓缩物以1：100的浓度进行稀释使用。

[0053]在可选的实施方式中，烟酰胺在第一培养基中的浓度不低于10mmol/L(可缩写为10mM，下同)，例如可以为10mmol/L(10mM)、15mmol/L(15mM)或20mmol/L(20mM)等。

[0054]在可选的实施方式中，烟酰胺对人多能干细胞的作用时间可以为4‑6天，如4天、5天或6天等。

[0055]在可选的实施方式中，可以是先将人多能干细胞向中胚层分化，再加入烟酰胺诱导向心肌方向分化。

较佳地，向中胚层分化是以细胞密度为60‑80％的人多能干细胞进行。

[0056]在实际操作中，可以通过打开Wnt/β‑catenin通路诱导人多能干细胞向中胚层分化。

可参照的，打开Wnt/β‑catenin通路可采用GSK3β抑制剂CHIR99021实现。

向中胚层分化过程所用的培养基为不含TGFβ、FGF2以及胰岛素但含脂质浓缩物(Chemically Defined Lipid Concentrate)的E5培养基。

[0057]进一步地，还包括在用含烟酰胺的第一培养基培养后，用含胰岛素的E5培养基继续培养分化，大致在分化9‑13天心肌细胞开始跳动，此时可检测到心肌标志物TNNT2的表达。

[0058]承上，也即可参照以下步骤：hPSC培养至细胞密度为60‑80％(如60％、70％或80％等)，用GSK3β抑制剂CHIR99021打开Wnt/β‑catenin通路诱导hPSCs向中胚层分化，接着加入烟酰胺诱导细胞向心肌方向分化。

处理4‑6天(如4天、5天或6天)后，继续培养至分化的第9‑13天即可检测到心肌标志物TNNT2的表达。

[0059]具体的，可参照：将人多能干细胞培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70‑80％(如70％、75％或80％等)时进行传代。

首先用DPBS‑EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS‑EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3‑1：6(如1：3、1：4、1：5或1：6等)密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。

细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。

待细胞长至60‑80％(如60％、70％或80％等)时开始分化，第一天加入含5μMCHIR99021的E5分化培养基。

1天后加入含10mM或20mM的烟酰胺的E5分化培养基，处理4天，期间每天更换含烟酰胺的E5培养基。

分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。

接着用含胰岛素的E5培养基继续培养分化细胞，大约在分化的9‑13天心肌细胞开始跳动。

[0060]进一步地，本申请还提供了一种心肌细胞的传代方法，其包括以下步骤：将心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中培养，第二培养基为E6培养基。

该心肌细胞可以但不限于参照以上诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法得到。

[0061]可参考地，不含烟酰胺的普通E6培养基的组成可以为：DMEM/F12，全转铁蛋白(holo‑transferrin)10μg/mL，亚硒酸钠(sodium selenite)14ng/mL，抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐(L‑Ascorbic acid 2‑phosphate sesquimagnesiumsalt hydrate)64μg/mL，脂质浓缩物(以1：100的浓度进行稀释使用)和胰岛素10μg/mL。

[0062]在可选的实施方式中，烟酰胺在第二培养基中的浓度不低于10mmol/L(10mM)，例如可以为10mmol/L(10mM)、15mmol/L(15mM)或20mmol/L(20mM)等。

[0063]较佳地，传代所用的心肌细胞为人多能干细胞往心肌细胞方向分化后第10‑15天的心肌细胞。

优选地，上述心肌细胞为人多能干细胞经IWP‑2或烟酰胺诱导的心肌细胞。

[0064]在可选的实施方式中，将消化成单细胞后的心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中，培养1‑2天后换成不含烟酰胺的第二培养基继续培养。

在此过程中，烟酰胺通过抑制ROCK通路促进心肌细胞存活，从而可显著提高心肌细胞传代时的存活率。

[0065]可参考地，可以是采用TrypLE进行消化处理，随后用牛血清白蛋白中和反应，固液分离，将除去消化液后的呈单细胞状态的心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中。

[0066]具体的，可参照：将人多能干细胞培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70‑80％时进行传代。

首先用DPBS‑EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS‑EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3‑1：6密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。

细胞贴壁1天后换E8培养基(如赛默飞世尔科学生命科学公司的Essential 8培养基)继续培养。

其中，E8培养基的组成可以为全转铁蛋白(holo‑transferrin)10μg/mL，亚硒酸钠(sodium selenite)14ng/mL，抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐(L‑Ascorbic acid 2‑phosphate sesquimagnesium salt hydrate)64μg/mL，胰岛素10μg/
mL，TGFβ1.74ng/ml及FGF2 100ng/mL。

[0067]待细胞长至60‑80％时开始分化，第一天加入含5μMCHIR99021的E5分化培养基。

第二天换上新鲜的E5分化培养基培养1天。

第三天加入含3μM IWP‑2的E5分化培养基，处理3天，期间每天更换含IWP‑2的E5培养基。

分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。

分化的第8天用含胰岛素的E5培养基(E6培养基)继续培养分化细胞，每1‑2天换一次培养液。

培养至10‑15天(如10天、11天、12天、13天、14天或15天等)后，用TrypLE消化心肌细胞，并用BSA中和反应，离心去除消化液，将心肌细胞重悬于含ROCK抑制剂Y27632 10μM，或含烟酰胺0.1、0.5、1、5、10、20mM的E6培养基。

[0068]进一步地，本申请还提供了一种心肌细胞的纯化方法，其包括以下步骤：将传代处理后的心肌细胞置于含烟酰胺的第三培养基中培养，第三培养基同样可以为E6培养基。

传代处理可以但不限于参照上述心肌细胞的传代方法。

[0069]在可选的实施方式中，烟酰胺在第三培养基中的浓度也不低于10mmol/L。

[0070]在可选的实施方式中，用于传代处理的心肌细胞为人多能干细胞往心肌细胞方向分化后第10‑15天的心肌细胞。

[0071]在可选的实施方式中，传代可以1:3‑1:4的比例进行。

[0072]较佳地，传代过程中加有ROCK抑制剂或烟酰胺。

[0073]可参考地，ROCK抑制剂可以但不仅限于为Y27632。

[0074]较佳地，ROCK抑制剂的添加浓度可以为5‑20μmmol/L(优选10μmmol/L)，烟酰胺的添加浓度可以为10‑20mmol/L。

[0075]较佳地，心肌细胞在含烟酰胺的第三培养基中培养4‑6天，每2‑3天更换一次新的含烟酰胺的第三培养基。

[0076]承上，本申请提供的上述诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法及心肌细胞的传代和纯化方法能够有效地培养和维持hPSC诱导分化的心肌细胞，并使hPSC诱导分化的心肌细胞传代变得容易，所得的心肌细胞存活率高，长期培养后的心肌细胞的纯度也可维持在较高程度。

并且，上述方法费用较低，利于大规模生产。

[0077]相应地，本申请还提供了一种药剂，其含有经上述诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法或经上述心肌细胞的传代方法或经上述心肌细胞的纯化方法得到的心肌细胞。

该药剂应用前景较广，可为心脏疾病的再生修复以及药物筛选提供材料。

[0078]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0079]实施例1
[0080]烟酰胺促进人胚胎干细胞H1向心肌细胞方向分化
[0081]人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％时进行传代。

首先用DPBS‑EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS‑EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。

细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。

待细胞长至60％时开始分化，第一天加入含5μM CHIR99021的E5分化培养基。

1天后加入含10mM或20mM的烟酰胺的E5分化培养基，处理4天，期间每天更换含烟酰胺的E5培养基。

分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。

接着用含胰岛素的E5培养基继续培养分化细胞，大约在分化的9‑10天心肌细胞开始跳动。

[0082]与此同时，本实施例还对烟酰胺处理的浓度和时间进行了优化，其结果如图1所示。

该图显示10mM或20mM烟酰胺显著促进心肌细胞标志基因表达，并且处理4‑6天可明显促进hPSC向心肌细胞方向分化。

[0083]图1中，A为hPSC向心肌方向分化示意图。

其中CHIR表示CHIR99021处理浓度5μM，IWP‑2作为心肌分化的阳性对照处理浓度3μM。

在分化开始前2天(D‑2)，hPSC培养在E8培养基里，分化的前7天(D0‑D7)，细胞培养在E5基础培养基里，7天后(D7‑结束)，在E5培养基中加入胰岛素继续培养至10天检测心肌细胞的标志物的基因表达情况。

[0084]B为不同浓度的烟酰胺(Nam)对心肌细胞的标志物NKX2‑5(上)和TNNT2(下)基因表达的影响图。

其中，*p<0.05，表示和不加烟酰胺的对照组(Nam 0)相比具有显著差异。

[0085]C为在分化的不同时间加入烟酰胺(Nam 10mM或20mM)，检测心肌细胞的标志物NKX2‑5(上)和TNNT2(下)的基因表达情况图。

[0086]由图1可以看出烟酰胺优选的处理浓度至少为10mM，处理时间至少为3天，优选的处理时间为分化的第1‑5天或第1‑7天(图1)。

[0087]进一步地，根据图1的结果采用烟酰胺在分化第1‑5天期间处理4天，阳性对照组采用IWP‑2 3μM在分化第2‑5天期间处理3天。

分化13天后，检测TNNT2阳性的心肌细胞的比例，以及心肌细胞的标志物NKX2‑5和TNNT2的表达情况，显示烟酰胺能有效诱导hPSC产生心肌细胞。

其中，TNNT2为心肌细胞特异性标志物，TNNT2阳性细胞指示了分化细胞中的心肌细胞。

[0088]图2中，A为通过流式细胞技术分析TNNT2阳性的心肌细胞的比例图。

浅灰色线指示isotype抗体阴性对照。

左上图代表阴性对照组，即不加入IWP‑2或烟酰胺进行诱导组；右上图代表IWP‑2诱导分化组；左下图代表烟酰胺10mM诱导分化组；右下图代表烟酰胺20mM诱导分化组。

[0089]B为采用针对NKX2‑5和TNNT2的抗体标记3μM IWP2和20mM烟酰胺诱导分化的心肌细胞图。

左图为NKX2‑5抗体染色结果，中间图为TNNT2抗体染色结果，右图为NKX2‑5、TNNT2和DAPI染色结果合并图。

标尺50μm。

[0090]由图2可以看出，在分化的第12‑15天检测TNNT2阳性细胞，结果显示烟酰胺诱导分化细胞中TNNT2阳性细胞的比例可达90％以上，说明烟酰胺诱导90％以上的H1细胞分化成心肌细胞。

[0091]此外，烟酰胺20mM在分化第1‑5天期间处理4天，阳性对照组采用IWP‑2 3μM在分化第2‑5天期间处理3天，分化30天后对心肌细胞的细胞骨架和电生理功能等进行分析，以图3示，显示烟酰胺诱导分化的心肌细胞具有成熟的细胞骨架结构，较高水平的心肌细胞标志物基因表达，并且具有心房细胞和心室细胞的正常电生理信号。

[0092]图3中，A为细胞骨架蛋白α‑Actinin在IWP2或烟酰胺诱导的心肌细胞中的表达情况图，条纹代表α‑Actinin，椭圆形代表DAPI。

标尺10μm。

[0093]B为统计α‑Actinin标记的肌节的长度图。

结果显示烟酰胺诱导得到的心肌细胞具有更长的肌节长度，提示该种心肌细胞的成熟度更高。

[0094]C为比较不同处理组的分化细胞的心肌相关基因表达情况图。

浅色提示基因表达水平较高，深色提示基因表达水平较低。

由此结果看出烟酰胺诱导的心肌细胞表达较高水平的心肌相关基因例如MYL2、MYH7、ACTN2、RYR2、TNNT2以及MYL7，而表达较低水平的心包膜
细胞基因WT1和TBX18。

[0095]D为分析烟酰胺诱导的心肌细胞的动作电位图。

显示该心肌细胞具有正常心房细胞和心室细胞的动作电位，表明该心肌细胞具备正常心肌细胞的电生理功能。

[0096]根据图3分析烟酰胺诱导分化得到的心肌细胞可得出：在分化的第25‑30天该细胞出现有规律的肌节结构，并高表达多种心肌细胞特异基因，具有心房肌细胞和心室肌细胞的动作电位。

说明烟酰胺诱导分化的心肌细胞具有人正常心肌细胞的细胞骨架结构和电生理功能。

[0097]实施例2
[0098]烟酰胺促进多种人多能干细胞向心肌细胞方向分化
[0099]人胚胎干细胞H9和人诱导性多能干细胞NL4细胞培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％时进行传代。

首先用DPBS‑EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS‑EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。

细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。

待细胞长至60％时开始分化，第一天加入含5μM CHIR99021的E5分化培养基。

1天后加入含10mM或20mM的烟酰胺的E5分化培养基，处理4天，期间每天更换含烟酰胺的E5培养基。

分化的第6天，换上E5培养基，并继续培养2天，期间每天换液。

接着用含胰岛素的E5培养基继续培养分化细胞，大约在分化的9‑10天心肌细胞开始跳动，此时检测该细胞表达较高水平的心肌细胞标志基因NKX2‑5和TNNT2。

在分化的第12‑15天检测TNNT2阳性的心肌细胞的比例可达60％以上(如图4)。

[0100]具体的，采用烟酰胺在分化第1‑5天期间处理4天，阳性对照组采用IWP‑2 3μM在分化第2‑5天期间处理3天。

分化10‑13天后，检测心肌细胞的标志物NKX2‑5和TNNT2的基因表达情况，以及TNNT2阳性的心肌细胞的比例。

结果显示烟酰胺能有效诱导多种hPSC产生心肌细胞。

[0101]图4中A为烟酰胺(Nam)诱导H9细胞分化成心肌细胞，分析该心肌细胞的NKX2‑5和TNNT2基因表达情况图。

*p<0.05，表示和不加烟酰胺的对照组相比具有显著差异。

[0102]B为烟酰胺(Nam)诱导NL4细胞分化成心肌细胞，分析该心肌细胞的NKX2‑5和TNNT2基因表达情况图。

*p<0.05，表示和不加烟酰胺的对照组相比具有显著差异。

[0103]C为烟酰胺(Nam)诱导H9细胞分化后，检测分化细胞的TNNT2阳性细胞的比例图。

图中浅灰色线指示isotype抗体阴性对照，从左到右依次是：阴性对照组，即不加入IWP‑2或烟酰胺进行诱导组；IWP‑2诱导分化组；烟酰胺10mM诱导分化组。

[0104]D为烟酰胺(Nam)诱导NL4细胞分化后，检测分化细胞的TNNT2阳性细胞的比例图。

图中浅灰色线指示isotype抗体阴性对照，从左到右依次是：阴性对照组，即不加入IWP‑2或烟酰胺进行诱导组；IWP‑2诱导分化组；烟酰胺10mM诱导分化组；烟酰胺20mM诱导分化组。

[0105]实施例3：
[0106]烟酰胺提高IWP‑2诱导的心肌细胞传代时的存活率
[0107]人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％时进行传代。

首先用DPBS‑EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS‑EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3密度铺到预先用基质胶包被好的12孔板里。

细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。

待细胞长至60％时开始分化，第一天加入含5μMCHIR99021的E5分化培养基。

第二天换上新鲜的E5分化培养基培养1天。

第三天加入含3μM。