流式细胞仪上机培训手册

流式细胞仪上机操作培训手册
一、样本处理
以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例
1)取样。

取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；
2)编号。

根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：
a)1号管：相应同型对照；
b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；
3)加样。

用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记
好的流式管底部；
4)洗涤。

加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；
5)染色。

弃上清，加入100 μl PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流
式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。

）
6)洗涤。

加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；
7)重悬。

弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCanto
II或BD Accuri C6)。

（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。

）8）试验结果分析。

（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。

参考值：
二、上机检测
BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪
1 打开流式细胞仪电源
2 启动计算机，打开软件登录
3 确保软件连接到流式细胞仪
必要时，点击Cytometer > connect
检查液体水平
1 启动流式细胞仪后，检查液体水平
低液面水平或者废液桶满都用红色指示。

2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。

3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。

检查气泡
1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。

2 如果没有看到气泡，进行第5步。

如果看到气泡，点击Cytometer > Cleaning
Modes >De-gas Flow Cell.
3 当完成信息出现后，点击OK。

4 如果还可以看到气泡，重复上述操作。

注意：如果打开流动室细胞进口门时出现错误信息，通过关闭进口门，并等待30秒关闭该信息。

5 当您完成上述操作后，在往下进行之前请先检查激光预热是否已经完成。

创建实验
1 按照需要，在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、获取控制板和双指数编辑器窗口。

2 创建文件夹：
A 在浏览器中选择数据库图标，并点击浏览器工具栏上的New Folder。

B 对该文件夹命名。

3 选择该文件夹，点击New Experriment来创建一个新实验。

4 对该实验进行重命名。

5 选择实验级别的细胞仪设置，然后点击Inspector(检测器)中的Parameters(参数)选项卡。

6 按照需要变更，添加或者删除参数。

运行样本并记录数据
1 将样品管安装到流式细胞仪中并点击Aquire Data(获取数据)。

A 把抽吸臂向左侧推。

B 把流式管放置到SIT上，确保试管竖直，并用力向上推试管直到试管完个停止并完个就位。

C 把抽吸臂放置到试管下的中心位置。

抽吸臂上有3个传感器引脚。

试管底部应定位在这些引脚的中心位置内。

2 调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。

3 必要时，点击阈值图标并对FSC阈值进行调节。

4 调节P1门仅围绕目的细胞群体。

5 调节好后，点击Record Data(记录数据)以记录数据。

6 获取停止，取出试管。

建立全局工作表
1 如果用户参数中启用了Default global worksheet(默认个局工作表)(默认选项)，则全局工作表已经存在。

展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。

（注：如果Default global worksheet被禁用，则通过点击浏览器工具栏中的New Global Worksheet(新个局工作表)按钮创建个局工作表。

）
2 使用设计对话框定义参数标记并指定各个试管要记录的细胞颗粒数。

标记会出现在点图轴上和所有的统计结果图中。

A 选择Experiment(实验)>Experiment Layout(实验布局)。

B 在Labels(标签)选项卡中，为试管输入适当的标签。

例如，在FITC域中输入CD3。

使用Tab键移动到下一个域。

3 在该全局工作表中，创建用预览数据的点图。

例如:创建PerCP-Cy5.5对SSC,FITC对APC, FITC对PE, FITC对PE-Cy7和F ITC对APC-Cy7点图。

设门
通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。

如：PBMC样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只
反映淋巴细胞亚群的荧光特性。

关机
1选择Cytometer(细胞仪)>Fluidics Shutdown(液流关闭)，并遵循所有的提示。

2关闭细胞仪电源。

3退出BD FACSDiva软件。

C6简要操作流程
开机
1.打开电脑，上样处放置一管双蒸水
2.打开C6仪器，其自动执行“startup”，时间约5min，期间禁止开盖
3.当软件显示仪器状态为“Cytometer Connected and ready”并亮绿灯时，则可以上样
4. （推荐用质控微球上机，FL1-H和FL2-H直方图中必须有八个峰，FL3-H中必须有6-8个峰，即仪器分辨率CV值满足标准）
采集样品
1.样品震荡混匀后置于上样二档处
2.设置流速，采样数目或时间或体积
3.点击“Dot Plot”或“Histogram”或“Density Plot”，选择需要的图形
4.点击坐标轴参数，从下拉菜单中选择需要的参数（如：“FL1-A”“FSC-A”）
5.点击“Plot Spec”，选择“linear”或者“log”，设置坐标轴显示范围
6.右击坐标轴参数，选择“Rename Parameters”，进行坐标轴重命名
7.选择“Display”中的“Events Display Settings”，选择显示的细胞数
8.选择样品位置，点击“run”，进行采样
9.取下样品
10.取新的流式细胞管置于上样针处，点击“backflush”，清洗上样针
11.样品命名
12.点击“Zoom In”，放大指定区域，设置阈值。

点击“Zoom Out”，返回放大
设门
1.在图像下方点击设门工具，圈定指定区域，设置为门
2.点击相应图像上方的“Gate”，选择该图像需要应用的门
设置补偿
若样本是双荧光或三荧光检测，则实际图像显示中会用到荧光补偿
1.点击“Set Color Compensation”
2.选择需要补偿的荧光参数，输入补偿值，点击“Save & Close”
分析统计
点击“Statistic”
可选择预览选择的样品图形，所有的Plot列表。

所有的Plots，Gates以及统计学的列表，从中选择需要显示的信息
关机清洗
1.放置一管去离子水，运行2min，清洗时＜10 Events/sec 才算干净
2.放置一管0.5%-1%有效氯的清洗液，运行2min
3.放置一管去离子水，运行2min，运行结束后去离子水保留在上样处
4.退出软件，关闭电脑
5.关闭电源键（按住时间小于5秒钟），仪器自动Shutdown，时间约为13min，完成后仪
器电源键自动关闭
三、数据分析
略。