一种应用天然免疫激活剂抗病毒的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010671915.0
(22)申请日 2020.07.14
(71)申请人 武汉科技大学
地址 430081 湖北省武汉市青山区和平大
道947号
(72)发明人 周翔　蔡苗苗　王柯　王晨光　
蒋争凡　张同存　
(74)专利代理机构 北京君有知识产权代理事务
所(普通合伙) 11630
代理人 焦丽雅
(51)Int.Cl.
C12Q 1/02(2006.01)
C12N 5/0786(2010.01)
C12N 5/09(2010.01)
(54)发明名称
一种应用天然免疫激活剂抗病毒的方法
(57)摘要
本发明涉及一种应用小分子化合物氯喹那
多抗病毒的方法，包括将有效浓度的氯喹那多应
用于待处理的细胞中；本发明方法能有效激活I
型干扰素信号通路，表达分泌大量的干扰素和干
扰素刺激基因，从而强烈抑制病毒感染和复制，
本发明方法安全、高效,使用简便易行，应用范围
广泛。

权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 111763706 A 2020.10.13
C N 111763706
A
1.一种应用小分子化合物氯喹那多抗病毒的方法，包括将有效浓度的氯喹那多应用于待处理的细胞中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述氯喹那多在细胞培养基的终浓度为20μM。

3.根据权利要求2所述的方法，其中先稀释氯喹那多得到20mM的氯喹那多工作液，按照工作液：细胞培养液＝1：1000的比例向细胞的培养基中加入氯喹那多工作液，使得氯喹那多在细胞培养基的终浓度为20μM，摇匀培养物，静置于37℃培养24小时。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中用无菌的DMSO液体稀释氯喹那多。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述方法包括以下具体步骤：
1)、培养THP-1细胞，悬浮，并使其进入稳定的指数分裂状态:
细胞复苏：从液氮罐中快速取出细胞，然后在37℃水浴中快速摇动约1-2min，水面要在冻存管盖以下，防止水进入冻存管；
转入平板：在超净台中，取一平板，先加入12mlGibco RPMI 1640培养液，铺满板底，然后把冻存管中的细胞全部吸到平板中，8字摇匀，显微观察状况，然后37℃培养；
细胞换液：复苏过夜后，观察培养液有变黄，此时换液，先把细胞液全部吸入15ml离心管中，900-1000r/min离心5min，转速不能大于1000，吸掉上层培养液，加入新的RPMI 1640，吹匀，全部吸到培养板中，37℃培养；
传代：采用直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶，注意细胞的密度一定要高，介于5×105～106/ ML之间，增值的快；
2)、培养HeLa细胞，贴壁，并使其进入稳定的指数分裂状态:
细胞复苏：从液氮罐中快速取出细胞，然后在37℃水浴中快速摇动约1-2min，水面要在冻存管盖以下，防止水进入冻存管；
转入平板：在超净台中，取一平板，先加入12mlGibco DMEM培养液，铺满板底，然后把冻存管中的细胞全部吸到平板中，8字摇匀，显微观察状况，然后37℃培养；
细胞换液：复苏过夜后，观察培养液有变黄，此时换液，吸掉上层培养液，加入新的DMEM，37℃培养；
传代：采用胰酶消化法：①用吸管吸去上清；②加入1ml胰酶孵育2-4min；③加入新的DMEM培养液轻轻吹打成细胞悬液；④按照1：4～1：6等分装入数个新的培养皿，注意细胞的密度适宜，一般2～3天传代一次；
3)、收集小鼠腹腔巨噬细胞，贴壁，用于抗病毒实验；
BALBc小鼠腹腔注射4℃预冷的PBS 5ml，轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，置于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min，1000rpm/min，弃上清，用PBS洗涤2遍，再用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，0.1％双抗溶液，调节至2×106/ml，接种于6孔板，置37℃，5％CO2培养箱培养；
4)、制备氯喹那多工作液，并应用于待处理的细胞中；
配置工作液：按照10倍稀释法，用无菌的DMSO液体稀释氯喹那多储备液，达到工作浓度：20mM；
按照工作液：细胞培养液＝1：1000的比例，向细胞的培养基中加入氯喹那多工作液，使得氯喹那多在细胞培养基的终浓度为20μM，8字摇匀培养物，静置于37℃培养24小时，待氯
喹那多充分进入细胞、激活胞内I型干扰素信号通路，大量表达I型干扰素，产生抗病毒效应。

一种应用天然免疫激活剂抗病毒的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种应用天然免疫激活剂抗病毒的方法，特别涉及一种应用具有高效抗病毒能力的小分子化合物激活天然免疫I型干扰素信号通路的方法。

背景技术
[0002]天然免疫是机体抵御病毒感染的第一道防线。

病毒的感染能够激活天然免疫抗病毒反应。

天然免疫系统中有一系列的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)，这些受体识别病毒来源的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)，并招募特异的接头蛋白介导下游的信号通路，从而导致大量I型干扰素和炎症因子的表达与分泌。

I型干扰素包括单一的interferonβ(IFNβ)和interferonα(IFNα)家族蛋白。

分泌的I型干扰素与位于细胞膜表面的干扰素受体结合，激活下游的JAK-STAT信号通路，启动大量干扰素刺激基因ISGs的表达，发挥抑制病毒复制、增殖与传播的作用。

因此，I型干扰素的诱导产生在抗病毒天然免疫反应中具有关键的作用。

[0003]许多的刺激因素都能诱导机体产生I型干扰素，发挥抗病毒的功能。

这些刺激包括：病毒感染、病毒来源的病原相关分子模式刺激、过量表达I型干扰素信号通路的关键蛋白质分子等等。

然而，这些刺激因素均无法应用于临床的抗病毒治疗。

干扰素本身尽管具有抗病毒的功能，但作为一种蛋白质，其作用受到活性和半衰期的影响，具有一定的局限性。

如何找到一种既能够激活免疫细胞产生I型干扰素，又不依赖于病毒本身的物质，与此同时还能满足药物活性和稳定性的要求，将能够非常有效的应用于病毒感染的临床治疗。

发明内容
[0004]本发明的目的在于解决现有的抗病毒临床治疗药物的不足，提供一种应用小分子化合物氯喹那多(Chlorquinaldol，C10H7C l2NO)抗病毒的方法，所述方法应用范围广泛、安全性可控，强烈激活细胞中的I型干扰素信号通路，产生抗病毒天然免疫反应。

[0005]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006]一种应用小分子化合物氯喹那多抗病毒的方法，包括将有效浓度的氯喹那多应用于待处理的细胞中。

[0007]较佳的，所述氯喹那多在细胞培养基的终浓度为20μM。

更佳的，用无菌的DMSO液体稀释氯喹那多得到20mM的氯喹那多工作液，按照工作液：细胞培养液＝1：1000的比例(同时在此范围内设置一个浓度梯度)，向细胞的培养基中加入氯喹那多工作液，使得氯喹那多在细胞培养基的终浓度为20μM(含此浓度的一个浓度梯度)，摇匀培养物，静置于37℃培养24小时。

[0008]进一步的，所述方法包括以下具体步骤：
[0009]1、培养THP-1细胞(悬浮)并使其进入稳定的指数分裂状态。

[0010]细胞复苏：从液氮罐中快速取出细胞，然后在37℃水浴中快速摇动约1-2min，水面要在冻存管盖以下，防止水进入冻存管。

[0011]转入平板：在超净台中，取一平板，先加入12ml Gibco RPMI 1640培养液，铺满板底，然后把冻存管中的细胞全部吸到平板中，8字摇匀，显微观察状况，然后37℃培养；[0012]细胞换液：复苏过夜后，观察培养液有变黄(2-3天)，此时换液，先把细胞液全部吸入15ml离心管中，900-1000r/min离心5min，(转速不能大于1000)，吸掉上层培养液，加入新的RPMI 1640，吹匀，全部吸到培养板中，37℃培养。

[0013]传代：采用直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；
③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶(皿)。

注意细胞的密度一定要高，介于5×105～106/ML之间，增值的快。

[0014]2、培养HeLa细胞(贴壁)并使其进入稳定的指数分裂状态。

[0015]细胞复苏：从液氮罐中快速取出细胞，然后在37℃水浴中快速摇动约1-2min，水面要在冻存管盖以下，防止水进入冻存管。

[0016]转入平板：在超净台中，取一平板，先加入12ml Gibco DMEM培养液，铺满板底，然后把冻存管中的细胞全部吸到平板中，8字摇匀，显微观察状况，然后37℃培养；
[0017]细胞换液：复苏过夜后，观察培养液有变黄，此时换液，吸掉上层培养液，加入新的DMEM，37℃培养。

[0018]传代：采用胰酶消化法：①用吸管吸去上清；②加入1ml胰酶孵育2-4min；③加入新的DMEM培养液轻轻吹打成细胞悬液；④按照1：4～1：6等分装入数个新的培养皿。

注意细胞的密度适宜，一般2～3天传代一次。

[0019]3、收集小鼠腹腔巨噬细胞(贴壁)用于抗病毒实验。

[0020]BALBc小鼠腹腔注射4℃预冷的PBS 5ml。

轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，置于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min (1000rpm/min)，弃上清，用PBS洗涤2遍。

再用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液(0.1％双抗溶液)调节至2×106/ml，接种于6孔板，置37℃，5％CO2培养箱培养。

[0021]4、制备氯喹那多工作液，并应用于待处理的细胞中。

[0022]配置工作液：按照10倍稀释法，用无菌的DMSO液体稀释氯喹那多储备液，达到工作浓度：20mM。

[0023]按照工作液：细胞培养液＝1：1000的比例(同时在此范围内设置一个浓度梯度)，向细胞的培养基中加入氯喹那多工作液，使得氯喹那多在细胞培养基的终浓度为20μM(含此浓度的一个浓度梯度)。

8字摇匀培养物，静置于37℃培养24小时，待氯喹那多充分进入细胞、激活胞内I型干扰素信号通路，大量表达I型干扰素，产生抗病毒效应。

[0024]5、多种生物化学、分子生物学、生物影像学方法鉴定细胞的抗病毒反应。

[0025](1)免疫荧光成像法和流式细胞仪验证氯喹那多强烈抑制带有绿色荧光蛋白的病毒颗粒在细胞内的复制和扩增。

[0026]稳定表达绿色荧光蛋白的重组病毒，在感染一定时间之后，进入细胞的病毒颗粒会表达GFP，用荧光显微镜在488nm的通道下可以清晰见到受感染的细胞呈绿色。

[0027]为了证明氯喹那多能够有效的抑制病毒的感染和复制，配置包含一定浓度梯度的氯喹那多工作液，加入处于指数期生长的细胞培养基中，37℃共孵育24小时后，加入不同种类表达绿色荧光蛋白的病毒感染细胞，以未经过氯喹那多孵育的细胞为对照，感染24-48小时之后：
[0028]①在荧光显微镜下观察用氯喹那多共孵育后表达病毒绿色荧光蛋白的细胞数量和未加氯喹那多的细胞中感染病毒的细胞数量；
[0029]②在流式细胞仪上用GFP绿色荧光蛋白通道对细胞进行分析。

藉此，半定量确定氯喹那多是否能引起感染病毒的细胞数量的显著差异。

[0030](2)RT-PCR法验证氯喹那多激活细胞内I型干扰素基因转录水平的上调。

[0031]氯喹那多在细胞内发挥抗病毒免疫反应，依赖于其强烈激活细胞内I型干扰素信号通路。

因此氯喹那多能够刺激细胞内I型干扰素基因在转录水平的上调。

[0032]为了验证氯喹那多激活细胞内I型干扰素基因转录水平的上调，配置包含一定浓度梯度的氯喹那多工作液，加入处于指数期生长的细胞培养基中，37℃共孵育24小时后，去掉培养基收集细胞，使用Trizol法提取细胞内的总RNA，用oligo-dT引物获得cDNA模板后，用I型干扰素基因的引物扩增。

本RT-PCR方法可以直观的获得氯喹那多刺激细胞内I型干扰素基因的转录上调。

[0033](3)蛋白质免疫印迹法验证氯喹那多强烈抑制细胞内病毒蛋白的表达。

[0034]细胞内的抗病毒反应是由天然免疫信号通路I型干扰素的激活来完成的。

因此，通过检测细胞内I型干扰素信号通路的活化状态以及干扰素刺激基因的表达，可以反应氯喹那多激活I型干扰素信号通路的作用。

[0035]为了验证氯喹那多能够高效的激活细胞中的I型干扰素信号通路，配置包含一定浓度梯度的氯喹那多工作液，加入处于指数期生长的细胞培养基中，37℃共孵育24小时后，去掉培养基收集细胞，用RIPA裂解液裂解细胞后，采用蛋白质免疫印迹Western blot的方法，检测细胞中表征I型干扰素激活的关键转录因子IRF3的磷酸化水平，以及干扰素刺激基因的表达量变化。

[0036]本发明的优点是：
[0037]1、本发明的核心试剂——小分子氯喹那多是一种天然免疫的高效激活物，可以非常显著的产生抗病毒感染的效果。

[0038]2、本发明所述的小分子化合物氯喹那多是一种安全的抗病毒试剂。

在实验过程中，无论是普通显微镜还是荧光显微镜观察，均未发现细胞状态在氯喹那多处理后发生任何异变，证明该小分子化合物很大程度上是一种安全、无显著毒副作用的抗病毒试剂。

[0039]3、本发明所述的小分子免疫激活剂能够很迅速的穿过细胞表面进入细胞，使用非常简便易行，直接共孵育即可诱导细胞产生抗病毒反应。

避免了其他类型的干扰素激动剂活性有限、半衰期短、需要血液注射给药等局限性。

[0040]4、本发明所述的小分子化合物氯喹那多可以适用于多种不同种类的培养细胞，其应用范围广泛，有利于多种不同抗病毒应激场合的使用。

附图说明：
[0041]图1为氯喹那多结构图，
[0042]图2为氯喹那多抑制DNA病毒的复制和增殖，
[0043]图3为氯喹那多抑制病毒在THP-1细胞内的复制增殖，
[0044]图4为氯喹那多刺激小鼠细胞产生I型干扰素，
[0045]图5为氯喹那多激活人THP-1细胞产生I型干扰素，
[0046]图6为不同浓度的氯喹那多抗病毒效应。

具体实施方式
[0047]以下实施例中，所使用的氯喹那多(Chlorquinaldol)结构如图1所示，氯喹那多储存液配制：将EP管中的干粉于4℃高速离心，按照表1所示的量加入无菌的DMSO充分溶解，配置成相应浓度的储存液。

待粉末溶解完全，颠倒EP管混合均匀并于4℃短暂离心后，分装于无菌的EP管中，可在-80℃保存2年。

[0048]
[0049]表1氯喹那多储备液的配置
[0050]氯喹那多工作液配制：
[0051]由-80℃冰箱取出分装的氯喹那多储备液，在常温充分融化后，按照使用浓度稀释于无菌的DMSO液体中，随即使用。

氯喹那多工作液均现配现用。

[0052]实施例1：20μM氯喹那多抑制病毒的复制和增殖
[0053]1、在THP-1细胞中加入20μM的氯喹那多预处理12小时后，用带有绿色荧光蛋白标记的DNA病毒HSV-1和VacV感染细胞，以未加氯喹那多预处理的细胞(Mock)作为对照。

[0054]结果显示：DNA病毒在未加氯喹那多处理的细胞中能进行高水平的感染、复制和增殖；而氯喹那多预处理的细胞中几乎完全观察不到有活性的病毒绿色荧光蛋白的表达(图2)。

[0055]2、在THP-1细胞中加入20μM的氯喹那多处理12小时后，用GFP绿色荧光蛋白标记的DNA病毒HSV-1感染细胞，以未加药物处理的细胞作为对照。

[0056]结果显示：(A)荧光成像显示氯喹那多几乎完全抑制病毒在细胞内的复制和增殖；
(B)流式细胞分析显示表达病毒荧光蛋白的细胞数量在氯喹那多处理后急剧降低(图3)。

[0057]实施例2：20μM氯喹那多诱导I型干扰素及干扰素刺激基因的表达上调
[0058]取BALBc小鼠腹腔注射2mL的3％巯基乙醇酸钠诱导5天，取小鼠的腹腔巨噬细胞加入不同浓度的氯喹那多处理18小时后，提取细胞总RNA进行RT-PCR实验检测如图所示的基因。

[0059]结果显示：20μM的氯喹那多能够特异地刺激小鼠Ifnβ和ISGs的表达上调，但不诱导炎症因子Il6的表达(图4)，高于此浓度或者低于此浓度的氯喹那多诱导干扰素相关基因的能力均不如最适浓度20μM。

[0060]实施例3：20μM氯喹那多激活细胞产生I型干扰素(参见图5)
[0061]在THP-1细胞中按梯度加入不同浓度的氯喹那多处理24小时，以RNA病毒SeV和DNA
病毒VacV感染细胞作为阳性对照。

(1)收集细胞培养上清液，通过I型干扰素Bioassay实验检测分泌至上清液中有活性的I型干扰素的产量(上方柱状图)；(2)裂解细胞用全蛋白进行Western blot实验检测如图所示的蛋白表达水平或磷酸化水平。

[0062]结果显示：20μM的氯喹那多能有效地引起转录因子IRF3的磷酸化激活并诱导干扰素刺激基因ISGs蛋白水平的表达上调(图5，方框)；低于此浓度的氯喹那多(如5μM和10μM)无法引起转录因子IRF3的磷酸化和干扰素刺激基因的表达(图5，方框左侧样品)，而高于此浓度的氯喹那多(如50μM和100μM)引起IRF3磷酸化和干扰素刺激基因的表达反而受到抑制，不如20μM氯喹那多的效果显著(图5，方框右侧样品)。

[0063]由此可见，本发明的关键点在于特定浓度的氯喹那多溶液，即使用终浓度为20μM 的氯喹那多具有最强的诱导产生I型干扰素，并抑制病毒复制和繁殖的效应。

[0064]实施例4：其他浓度下氯喹那多的抗病毒效应均不如最适浓度20μM
[0065]在THP-1细胞中加入不同浓度的氯喹那多(10μM、20μM、50μM、100μM)预处理12小时后，用带有绿色荧光蛋白标记的RNA病毒NDV感染细胞，以未加氯喹那多预处理的细胞(0μM)作为对照。

[0066]结果显示：RNA病毒在未加氯喹那多处理的细胞中能进行高水平的感染、复制和增殖(0μM)；氯喹那多预处理的细胞中可以观察到病毒的复制增殖受到不同程度的抑制，其中，以最适浓度20μM的氯喹那多处理的细胞中对病毒的抑制程度最彻底，而无论是低于此浓度或者高于此浓度，氯喹那多的抗病毒效应反而有不同程度的下降(图6)。

图1
图2
图3
图4
图5
图6
说　明　书　附　图3/3页CN 111763706 A 11。