灵芝多糖对失血性休克复苏时肠粘膜损伤的保护作用及机制

灵芝多糖对失血性休克复苏时肠粘膜损伤的保护作用及机制杨红梅;陈洁;王黎
【摘要】目的:探讨灵芝多糖(GLP)对失血性休克再灌注复苏时肠粘膜损伤的保护作用及机制.方法:复制家兔失血性休克再灌注复苏模型,随机分成假手术组(S组)、生理盐水再灌注复苏组(NS组)和质量分数为1%的GLP再灌注复苏组(LS组),于放血前、休克40min、再灌注复苏40min 和 90min时观察细菌的移位情况;复苏90 min时,检测肠粘膜SOD活性、MDA和TNFα含量的变化;同时取回肠末端观察肠粘膜的损伤情况和用TUNEL法检测肠粘膜细胞凋亡情况.结果:①随着再灌注复苏时间的延续,NS组血液细菌阳性率增加,细菌移位增加,明显高于LS组和S组 (P＜0.05);②NS组和LS组肠粘膜SOD活性明显低于S组,而LS组又明显高于NS组(P＜0.05);NS组和LS组肠粘膜MDA和TNFα含量明显高于S组,而LS组又明显低于NS组(P＜0.05) ;③NS组肠粘膜损伤明显重于S组和LS组,且肠粘膜凋亡细胞百分数也明显高于S组和LS组(P＜0.05).结论:失血性休克再灌注复苏过程中肠粘膜的损伤与局部脂质过氧化反应增强、TNFα介导的炎症反应及肠粘膜细胞的凋亡增多等有关,而GLP对此损伤有保护作用.
【期刊名称】《陕西医学杂志》
【年(卷),期】2010(039)002
【总页数】3页(P134-136)
【关键词】灵芝属;休克;出血性;再灌注;肠粘膜;细胞凋亡;TNFα
【作者】杨红梅;陈洁;王黎
【作者单位】河南职工医学院,郑州,450003;河南职工医学院,郑州,450003;河南职工医学院,郑州,450003
【正文语种】中文
【中图分类】R657.2
失血性休克及复苏过程中,肠粘膜最易发生损伤,导致肠粘膜的屏障作用破坏,并引起其他脏器的继发性损伤,导致多器官功能衰竭[1]。

灵芝多糖(ganoderma lucidum polysaccharide,GLP)是灵芝的有效成分之一,已证明其对失血性休克再灌注损伤有保护作用[2,3],本实验通过复制家兔失血性休克再灌注复苏模型,观察了失血性休克复苏过程中肠粘膜屏障功能的变化及GLP的保护作用和可能的作用机制,以期为临床危重病人的救治提供新的理论依据。

材料和方法
1 实验药物 GLP购自保定施达科生物工程技术有限公司,系采用超声波酶法从人工栽培的赤芝中提取,其主要成分是 L岩藻糖、D半乳糖、D甘露糖、D木糖和D葡聚糖等具有生理活性的单糖聚合体,1g灵芝多糖相当于22.2g生药。

溶于加热的生理盐水,制成质量分数为1%的灵芝多糖溶液,无菌过滤备用。

2 动物模型复制与实验分组体质量为2.5～3.0 kg成年健康家兔 30只,雌雄不限,随机分为假手术组(S组)、生理盐水再灌注组(NS组)和GLP再灌注组(LS组)3组,每组 10只。

用质量分数为3%的异戊巴比妥钠30mg/kg经耳缘静脉注入麻醉,气管切开插管,自主呼吸;右侧颈外静脉插管,供输液、输药用;左侧颈总动脉插管,通过BL-420智能型生物信号采集与处理系统(成都泰盟电子有限公司)连续监测血压;左侧股动脉插管,用于放血、采集血样。

全身肝素化后,记录血压,按 15ml/kg快速放血,使平均动脉血压(MAP)在10min内下降至40 mm Hg(1mmHg=0.133k Pa),
通过调整血容量维持 MAP在 40 mm Hg 40min。

然后NS组快速回输自体肝素化血,并静脉滴注 2倍量的生理盐水,分别于放血前(BI)、休克40min(S40)及再灌注复苏40min(R40)和90 min(R90)时取血样;LS组用质量分数为1%的GLP代替生理盐水,其余同NS组;S组只做手术不放血。

3 检测指标(1)细菌培养及鉴定:于放血前、休克40min、再灌注后复苏40min和90min时严格无菌条件下经股动脉采集血样,迅速置于乙酸钠液体培养基中,37℃培养,阳性管进行需氧菌和厌氧菌分离培养,分别用 G+菌、G-菌和厌氧菌鉴定实验卡进行鉴定,以自动微生物系统仪判定结果。

(2)肠粘膜 SOD活性、MDA和TNFα含量检测:再灌注复苏 90 min时,快速处死动物,低温下刮取肠粘膜制备 10%的匀浆,3 000r/min离心,取上清,检测 MDA和TNFα含量和SOD活性,SOD活性用黄嘌呤氧化酶法,MDA用硫代巴比妥酸比色法,TNFα用放射免疫法检测,试剂盒购自南京聚力生物医学工程研究所,严格按试剂盒说明进行操作检测。

(3)光镜观察和肠粘膜细胞凋亡的检测:动物处死后取末端回肠 2cm制作光镜标本,分别进行 HE染色观察肠绒毛的损伤程度和应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位末端平移(TUNEL)法检测肠粘膜细胞凋亡情况,每张切片观察 10个高倍视野,计算染色阳性细胞百分数。

肠粘膜损伤分级依据Chiu肠粘膜损伤评分方法进行[4]。

4 统计学处理计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,采用t检验;等级资料两样本比较采用秩和检验,P＜0.05为差异有显著性。

结果
1 细菌培养及鉴定结果见表1。

3组动物于放血前血液细菌培养均为阴性,没有细菌移位发生(P＞0.05)。

NS组和LS组于失血性休克 40min时均有2例血液细菌培养阳性,而随着再灌注时间的延续,NS组血液细菌培养阳性率逐渐增加,细菌移位增加,明显高于LS组,培养的阳性菌经鉴定,以大肠杆菌最为多见,其余菌种依次为肠球菌、粪链球菌、嗜酸乳杆菌、葡萄球菌等。

表1 细菌移位情况(n=10)注:与BI期及LS组同时期比较,*P＜0.05,**P＜0.01LS组0/10 2/10 2/10 4/10*
2 肠粘膜 SOD活性、MDA和TNFα含量变化见表2。

NS组和LS组肠粘膜 SOD 活性明显低于S组,而 LS组又明显高于NS组(P＜0.05);NS组和LS组肠粘膜MDA和TNFα含量明显高于S组,而 LS组又明显低于NS组(P＜0.05)。

表2 3组肠粘膜 SOD活性、MDA和TNFα含量变化(n=10,±s)注:与S组比较,* P＜0.05;与NS组比较,# P＜0.05NS组145.50±71.318.19±0.327.76±1.07 LS 组246.46±57.73*# 5.73±0.61*# 6.11±0.94*#
3 光镜观察结果见表3,附图。

S组肠粘膜上皮细胞层完整,腺体结构未见异常;NS 组肠绒毛水肿,上皮层下间隙增宽,间质疏松,排列混乱,损伤脱落明显,固有层血管充血,中性粒细胞和淋巴细胞浸润;而 LS组肠粘膜损伤较NS组明显减轻。

4 TUNEL法检测结果 NS组肠粘膜凋亡细胞百分数(46.82±6.1)% 明显高于S组(32.41±4.4)%和LS组(38.67±3.7)%(P＜0.05)。

附图肠粘膜损伤情况(HE×200)
表3 3组肠粘膜损伤Chiu评分比较(n=10,±s)注:与S组比较,* P＜0.05;与NS组比较,# P＜0.05NS组3.79±1.23*LS组1.44±0.64*#
讨论
研究表明,缺血再灌注损伤的主要机制是氧自由基介导的脂质过氧化反应和炎性因子触发的全身炎性反应(SIRS)[5],丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)是反映脂质过氧化反应的敏感指标,肿瘤坏死因子(TNFα)是机体细胞因子网络的重要成分,可以促进和放大炎症损伤反应[6]。

另有研究表明,创伤失血后,机体各脏器早期即发生大量细胞凋亡,进一步加重脏器功能障碍,尤其是肠粘膜细胞大量凋亡时所致的肠粘膜屏障功能破坏可造成细菌、内毒素移位而促进SIRS和多脏器功能衰竭(MOF)的发生发展[7]。

本研究结果表明,休克 40 min后用生理盐水再灌注复苏时,肠粘膜的损伤、细菌移
位和细胞凋亡百分数明显高于S组,同时 SOD活性则明显低于S组(P＜0.05),而MDA和TNFα含量则明显高于S组(P＜0.05),说明失血性休克复苏时氧自由基介
导的脂质过氧化反应和TNFα触发的全身炎症反应以及肠粘膜细胞的大量凋亡共
同参与了失血性休克再灌注复苏时肠粘膜的损伤,从而使肠粘膜的屏障功能降低,通
透性增加,肠道细菌及内毒素等通过损伤的肠粘膜侵入血液循环,出现细菌移位现象
而引发细菌和内毒素血症,促进了SIRS和MOF的发生发展。

灵芝是我国传统的延年益寿中药,具有“益精气、扶正固本”的作用。

灵芝多糖是
灵芝的主要有效成分之一,以前的研究表明,灵芝多糖具有清除体内自由基、抗氧化、保护失血性休克再灌注时心肌损伤的作用[8],本实验中,失血性休克用灵芝多糖再灌注时肠粘膜的损伤、细菌移位明显低于NS组而 SOD活性明显高于NS组,MDA
和TNFα含量及肠粘膜细胞凋亡数目则明显低于NS组(P＜0.05),说明灵芝多糖可
能是通过抑制脂质过氧化反应和减少细胞因子TNFα和细胞凋亡而对失血性休克
再灌注过程中肠粘膜的再灌注损伤起保护作用的。

参考文献
[1] Swank GM,Deitch EA.Rode of the gut in multiple organ failure:bacterial translocation and permeability changes[J].World JSurg,1996,20(4):411-417.
[2] 杨红梅,王黎,陈洁,等.灵芝多糖对兔失血性休克血液流变学的实验研究 [J].中医药学刊,2004,22(5):914-915.
[3] 杨红梅,王黎,陈洁,等.失血性休克再灌注心肌损伤机制及灵芝多糖的预防作用[J].河南职工医学院学报,2003,15(3):8-10.
[4] Chiu CJ,Mcardle AH,Brown R,etal.Intestinal mucosal lesion in lowflow states[J].Arch Surg,1970,101(4):478-483.
[5] 邹捍东,吴灵,周有山,等.阿魏酸对兔失血性休克腹腔脏器再灌注损伤的保护作用
[J].中国临床康复,2006,10(43):114-116.
[6] 姜小国,胡森,石德光,等.卡巴胆碱对肠缺血再灌注大鼠血浆肿瘤坏死因子-α和白介素-10含量的影响 [J].中国危重病急救医学,2003,15(3):167-168.
[7] 夏中元,罗涛,夏芳,等.生脉注射液对肠粘膜再灌注损伤保护作用机制的实验研究 [J].中华麻醉学杂志,2001,21(5):299-301.
[8] 杨红梅,王黎,陈洁,等.失血性休克复苏时心肌损伤和一氧化氮的变化及灵芝多糖的干预作用[J].中国中西医结合急救杂志,2003,10(5):304-306.。