细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110230083.3
(22)申请日 2021.03.02
(71)申请人 江南大学
地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大
道1800号
(72)发明人 贾煊杰　许国超　石金田　倪晔　
郑香玉　
(74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代
理事务所(普通合伙) 32257
代理人 王玉仙
(51)Int.Cl.
C12P 33/00(2006.01)
C12N 9/02(2006.01)
C12N 15/53(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产
熊去氧胆酸中的应用
(57)摘要
本发明公开了一种细胞色素P450单加氧酶
在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用。

本发明
提供的细胞色素P450单加氧酶作为催化剂在石
胆酸制备熊去氧胆酸的应用中，立体和区位选择
性好，底物浓度高，反应条件温和，对环境友好，
操作简便，易于工业放大。

因此，本发明所述细胞
色素P450单加氧酶及其基因具有很好的工业应
用开发前景。

权利要求书1页 说明书4页序列表3页 附图1页CN 112831536 A 2021.05.25
C N 112831536
A
1.一种细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用，其特征在于，所述的细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用具体包括：在缓冲液中，在所述细胞色素P450单加氧酶的催化下，利用石胆酸进行氧化反应，形成熊去氧胆酸。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐浓度为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的氧化反应的温度为25～35℃；反应时间为2～24小时。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
所述的石胆酸的浓度为1～50mmol/L。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的细胞色素P450单加氧酶的用量为1～10kU/L。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的细胞色素P450单加氧酶的添加形式为含有细胞色素P450单加氧酶的粗酶液或冻干细胞。

9.一种携带编码细胞色素P450单加氧酶的基因的载体，其特征在于，其中，所述的细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

10.一种表达细胞色素P450单加氧酶的重组菌，其特征在于，其中，所述的细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

权　利　要　求　书1/1页CN 112831536 A
细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的
应用
技术领域
[0001]本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用。

背景技术
[0002]熊去氧胆酸(UDCA)，化学名为3a,7β‑二羟基‑5β‑胆甾烷‑24‑酸，为白色粉末状固
体，分子式为C
24H
40
O
4
，分子量为392.57，CAS号为128‑13‑2，熔点为203℃，沸点为547℃，几乎
不溶于水。

[0003]熊去氧胆酸已被广泛应用于医药领域，用于治疗治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。

熊去氧胆酸的合成有化学法和生物法两种。

其中化学合成法一般采用从胆酸出发七步合成或从非胆酸类甾体出发来完成熊去氧胆酸的制备，此两种方法都存在反应收率低、产物纯度低、生产成本高的缺点，难以工业化生产。

与化学法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、经济和环境效益较高等优点。

生物法包括动力学拆分和合成。

[0004]生物合成法研究较多的是用野生菌或重组工程菌的整细胞或游离酶进行催化。

Catherine Juste等报道了从人体排泄物中分离得到的五种菌都能将鹅脱氧胆酸转化为熊去氧胆酸，经过基因序列比对确定这五种菌都是Clostridium baratii。

五种菌在培养48h 后，熊去氧胆酸最高产率为75.9％，最低产率为52.0％；Ian A.Macdonald等人成功分离8种野生菌(Clostridium absonum)，它们都同时包含7α‑和7β‑HSDH，利用这些野生菌能将胆酸转化成熊胆酸或将鹅脱氧胆酸转化成熊脱氧胆酸。

但是整细胞转化胆酸或鹅脱氧胆酸的浓度分别低于1.5mM和0.5mM，更高浓度则会抑制细胞生长和底物转化。

分别培养15‑22h和9‑15h后产率为60‑70％；Sergio Riva等报道了从胆酸一锅煮合成12‑羰基‑熊去氧胆酸的方法，反应中混合了五种酶，其中三种酶是：7α‑HSDH克隆自B.fragilis菌株、12α‑HSDH来源于未知序列的商业途径和7β‑HSDH克隆自C.absonum，其中前两种酶起氧化作用，属于NADH依赖型，7β‑HSDH起氧化作用，属于NADPH依赖性，通过不同的辅酶依赖性，结合不同的辅酶循环实现一锅煮。

为了NAD+的再生，采用了乳酸脱氢酶/丙酮酸系统，同样为了NADP+的再生，采用了来源于Thermoplasma acidophilum的高度NADPH依赖性的葡萄糖脱氢酶。

反应5h之后胆酸完全转化为12‑羰基‑熊去氧胆酸，但是24h之后又有中间产物出现，所以没有实现真正的一锅煮。

[0005]然而，以上方法仅限于实验室规模，且存在羟化酶的自身活力低，产物浓度不高，步骤繁琐以及酶热稳定性差等缺陷，不适合工业化生产熊去氧胆酸。

因此，筛选活力高，且能在较短时间内获得较高产物浓度的细胞色素P450单加氧酶，以满足工业化生产熊去氧胆酸的需求具有非常重要的意义。

发明内容
[0006]本发明所要解决的技术问题是，针对现有的生物催化制备熊去氧胆酸的反应中，酶活力偏低、步骤繁琐和产物浓度不够高的缺陷，开发了从石胆酸一步羟化法合成熊去氧胆酸的简短合成路线，并提供一种具有优异的催化活性的细胞色素P450单加氧酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及重组酶和该重组酶的制备方法，以及该细胞色素P450单加氧酶的应用。

[0007]本发明的第一个目的是提供了一种细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用，所述的细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008]进一步地，所述的细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009]进一步地，所述的应用具体包括：在缓冲液中，在所述细胞色素P450单加氧酶的催化下，利用石胆酸进行氧化反应，形成熊去氧胆酸。

[0010]进一步地，所述的缓冲液为磷酸盐浓度为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

[0011]进一步地，所述的氧化反应的温度为25～35℃；反应时间为2～24小时。

[0012]进一步地，所述的石胆酸的浓度为1～50mmol/L。

[0013]进一步地，所述的细胞色素P450单加氧酶的用量为1～10kU/L。

[0014]进一步地，所述的细胞色素P450单加氧酶的添加形式为含有细胞色素P450单加氧酶的粗酶液或冻干细胞。

[0015]本发明的第二个目的是提供一种携带编码细胞色素P450单加氧酶的基因的载体，其中，所述的细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0016]本发明的第三个目的是提供一种表达细胞色素P450单加氧酶的重组菌，其中，所述的细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0017]借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0018]本发明提供的细胞色素P450单加氧酶作为催化剂在石胆酸制备熊去氧胆酸的应用中，立体和区位选择性好，底物浓度高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大。

因此，本发明所述细胞色素P450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

[0019]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明
[0020]图1是粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式
[0021]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。

[0022]表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

[0023] E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DNA Marker，购自北京天根生化科技有限公司。

[0024]限制性内切酶NdeI和XhoI购自大连宝生物有限公司。

[0025]实施例1：细胞色素P450单加氧酶基因的克隆
[0026]根据Genbank收录的预测为单加氧酶的Allokutzneria albata菌的基因组(基因登录号：SDN52915.1)为依据，设计PCR引物如下(SEQ ID NO.3～4)：
[0027]上游引物：5'‑gtgccgcgcggcagccatatgATGACCGCCGTCGATCCC‑3'
[0028]下游引物：5'‑gtggtggtggtggtgctcgagTCACCAGCTCACCGGAAGG‑3'；
[0029]其中，上游引物下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物部分为XhoI酶切位点。

[0030]以Allokutzneria albata菌的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板1μL(0.1μg)和O 7.0μL。

PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性30s；(3)55℃退火30s；ddH
2
(4)72℃延伸1.5min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。

获得一条完整的细胞色素P450单加氧酶全长基因序列，经DNA测序，全长1212bp，命名为CYP。

所述基因核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。

[0031]实施例2：细胞色素P450单加氧酶重组质粒和重组表达转化体的制备
[0032]将实施例1所得的细胞色素P450单加氧酶基因DNA片段及pET28a空质粒在37℃用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂
DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质盒回收目标片段。

将目标片段在T
4
粒pET28a‑CYP。

[0033]将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。

培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a‑CYP，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。

[0034]实施例3：细胞色素P450单加氧酶的表达
[0035]将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL
达到0.6时，LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD
600
加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，冷冻干燥24h即可得冻干细胞，收集后4℃保存。

还可将所得的静息细胞悬浮于pH7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组细胞色素P450单加氧酶的粗酶液。

所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图1)，重组细胞色素P450单加氧酶以可溶的形式存在。

[0036]实施例4：细胞色素P450单加氧酶活力的测定
[0037]通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定细胞色素P450单加氧酶的活力。

细胞色素P450单加氧酶活力测定方法如下：于200μL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0)中，加入1mmol/L石胆酸，1mmol/L NADPH，加入适量实施例3制备的粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。

每单位细胞色素P450单加氧酶的活力(U)定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADPH所需的酶量。

[0038]实施例5～8：细胞色素P450单加氧酶催化石胆酸的氧化反应
[0039]在100mg/mL DMSO溶液中加入实施例3制备的CYP粗酶液粗酶液，使细胞色素P450单加氧酶的含量为2000U/L、1000U/L、500U/L、200U/L，加入石胆酸至终浓度分别为10mmol/ L。

反应在28℃下进行，24小时。

通过离心(3000×g，30分钟，4℃)停止反应。

结果见表1。

[0040]产物转化率的具体分析条件如下：
[0041]样品(500μL)用1mL乙酸乙酯萃取2次。

合并的有机相在无水硫酸钠上干燥。

乙酸乙酯完全蒸发后，残渣溶解在250μL乙醇中。

使用高效液相色谱仪进行分析，Luna Omega 5μm PS C18液相色谱柱，流动相为乙腈：水1:1(体积比)，含0.1％三氟乙酸，40℃的柱温下采用等度法(1mL/min)。

用加热至40℃的LaChrom Elite L‑2490示差检测器检测胆汁酸。

[0042]表1CYP不同添加量下氧化反应情况
[0043]
[0044]实施例9～11：细胞色素P450单加氧酶催化石胆酸的氧化反应
[0045]在100mg/mL DMSO溶液中加入实施例3制备的CYP粗酶液，分别加入终浓度为20mmol/L，40mmol/L或50mmol/L的石胆酸，CYP粗酶液的添加量依次为4kU/L，8kU/L或10kU/ L。

反应均在28℃下进行24小时。

通过离心(3000×g，10分钟，4℃)停止反应。

结果见表2。

由此可见，单加氧酶CYP具有较稳定的催化效果，可以完全转化50mmol石胆酸合成熊去氧胆酸。

[0046]对于实施例11将上清移至新的离心管中，用1M HCl调节pH至5.0，移入分液漏斗
中，加入2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，加入无水Na
2SO
4
过夜干燥后旋蒸至恒重，
即可得到熊去氧胆酸。

所得产物为白色晶体，产物摩尔收率为95.9％，光学纯度为99％(R)。

[0047]表2 CYP催化石胆酸氧化合成熊去氧胆酸
[0048]
[0049]以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表
<110> 江南大学
<120> 细胞色素P450单加氧酶在催化石胆酸生产熊去氧胆酸中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1212
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atgaccgccg tcgatcccac cacctcggcg ccgtcgtacc cgttcagcct gccgagggca 60 ctcgacctcg acccgatcta cgaacgcctg cgccgcgacg agccgatcac ccgggtccgc 120 atgccctacg gcgagggcac ggcgtggctg gtcacccggc acgccgacgc caaggtcgtg 180 ctcggcgacc cgaggttcag caccgccgcg gggaccacgc cggagacccc gcgcagcacg 240 ccgctgccgc tggaccccga aggcatcctg ggcatggacg cgcccgagca cacccggctg 300 cggcgcttgg tggccaaggc gttcaccgcg cgccgggtcg agcagatgcg gccccggctg 360 cgtgaggtgg tcgacgccgc gctcacggag atggagcagc acggcgcgcc cgccgacctg 420 gtgcacttcc tggcgctgcc gctgcccgtg acggtcatct gcgacatgct cggcgtgccc 480 tacgaggacc ggcacctgtt ccgcgagttc tccgacgccg ccctgtcgac cacgaagtac 540 accccggagc agatccgcga cgcacgggac aagttcctcg cctacatggg cggcctggtc 600 gcgcagcgcc gcgcggagcc caccgacgac ctgctcggcg cactcgtgct ggccagggac 660 aacgacgacc ggctctcgga gatggagctg gtgcggctgg gcatcggtct gctcgtcgcg 720 ggccacgaga ccacggcgaa ccagctcacg aacttcacct acctgctgct cagcgagcgg 780 gagcggtacg aggcgctggt cgccgacccg tcgctggtgc ccgcggccgt ggaggagatg 840 ctgcgcttca ccccgctcgg cgcctccggc ggcttcgtgc gggtcgcgct ggaggacgtg 900 gagctggccg gggtgaccgt gcgcaagggg gagtccgtct tcgcccagct cgcgtcggcc 960 aaccgggacg aggcgatctt cgaccagccg gaccggatcg acttcacccg gcagcacaac 1020 ccgcacatgg ccttcgggca cggcgtgcac cactgcctcg gcgcgcagct tgcccgcttg 1080 gagctgcagg tggcgctgga ggggatgatc gcccgcttcc cgggcctgcg cttcgccgtg 1140 cccgcggagg agctgccctg gcgcacgggg atgctcgtcc ggggactgga agcccttccg 1200 gtgagctggt ga 1212
<210> 2
<211> 403
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Met Thr Ala Val Asp Pro Thr Thr Ser Ala Pro Ser Tyr Pro Phe Ser
1 5 10 15
Leu Pro Arg Ala Leu Asp Leu Asp Pro Ile Tyr Glu Arg Leu Arg Arg
20 25 30
Asp Glu Pro Ile Thr Arg Val Arg Met Pro Tyr Gly Glu Gly Thr Ala
35 40 45
Trp Leu Val Thr Arg His Ala Asp Ala Lys Val Val Leu Gly Asp Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Thr Ala Ala Gly Thr Thr Pro Glu Thr Pro Arg Ser Thr 65 70 75 80 Pro Leu Pro Leu Asp Pro Glu Gly Ile Leu Gly Met Asp Ala Pro Glu
85 90 95
His Thr Arg Leu Arg Arg Leu Val Ala Lys Ala Phe Thr Ala Arg Arg 100 105 110
Val Glu Gln Met Arg Pro Arg Leu Arg Glu Val Val Asp Ala Ala Leu 115 120 125
Thr Glu Met Glu Gln His Gly Ala Pro Ala Asp Leu Val His Phe Leu 130 135 140
Ala Leu Pro Leu Pro Val Thr Val Ile Cys Asp Met Leu Gly Val Pro 145 150 155 160 Tyr Glu Asp Arg His Leu Phe Arg Glu Phe Ser Asp Ala Ala Leu Ser
165 170 175
Thr Thr Lys Tyr Thr Pro Glu Gln Ile Arg Asp Ala Arg Asp Lys Phe 180 185 190
Leu Ala Tyr Met Gly Gly Leu Val Ala Gln Arg Arg Ala Glu Pro Thr 195 200 205
Asp Asp Leu Leu Gly Ala Leu Val Leu Ala Arg Asp Asn Asp Asp Arg 210 215 220
Leu Ser Glu Met Glu Leu Val Arg Leu Gly Ile Gly Leu Leu Val Ala 225 230 235 240 Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Gln Leu Thr Asn Phe Thr Tyr Leu Leu
245 250 255
Leu Ser Glu Arg Glu Arg Tyr Glu Ala Leu Val Ala Asp Pro Ser Leu 260 265 270
Val Pro Ala Ala Val Glu Glu Met Leu Arg Phe Thr Pro Leu Gly Ala 275 280 285
Ser Gly Gly Phe Val Arg Val Ala Leu Glu Asp Val Glu Leu Ala Gly 290 295 300
Val Thr Val Arg Lys Gly Glu Ser Val Phe Ala Gln Leu Ala Ser Ala 305 310 315 320 Asn Arg Asp Glu Ala Ile Phe Asp Gln Pro Asp Arg Ile Asp Phe Thr
325 330 335
Arg Gln His Asn Pro His Met Ala Phe Gly His Gly Val His His Cys 340 345 350
Leu Gly Ala Gln Leu Ala Arg Leu Glu Leu Gln Val Ala Leu Glu Gly 355 360 365
Met Ile Ala Arg Phe Pro Gly Leu Arg Phe Ala Val Pro Ala Glu Glu 370 375 380
Leu Pro Trp Arg Thr Gly Met Leu Val Arg Gly Leu Glu Ala Leu Pro 385 390 395 400 Val Ser Trp
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
gtgccgcgcg gcagccatat gatgaccgcc gtcgatccc 39
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
gtggtggtgg tggtgctcga gtcaccagct caccggaagg 40
说　明　书　附　图1/1页CN 112831536 A
图1。