RT-PCR总结
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
RT-PCR经验浅谈
RT-PCR经验浅谈Hxwuchina做RNA病毒基因的RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备。
本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增，设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等，分别进行RT-PCR扩增，刚开始的三个月，我们课题组三个人辛辛苦苦，什么招都想过了，结果连一个片段都没有拿到。
后来有一个周末，我一个人安安静静做了一天，PCR跑胶的结果足以让我兴奋一个月：一下子隐隐约约出了3个片段！！！紧接着把胶里的弱带切下，水溶并后做二次扩增(注：跑胶总会吧，在UV下，参照marker，将特异性高，且与预期大小相同的DNA带切出，放在一个ep管里，加入适量无菌水，用枪头将胶反复搅碎，高速离心，小心吸取2ul上清用作模板，进行第二次PCR扩增)很快，三个预期的片段都得到了理想的扩增。
不到一个月，12kb的全基因组各片段全部收归囊下。
我这次成功的关键在于：提取RNA时，收集沉淀这一步。
离心速度不要低于13000rpm （r=5cm），提高离心速度、延长离心时间，在离心前的沉淀也尽可能在低温下长时间进行，这些时我本人总结出来的经验。
在后来的实验中，几乎每次RT-PCR都非常顺利，除了材料本身就没有目标基因。
这一次谈一下逆转录酶和逆转录反应的问题，在一般的逆转录反应中，较常用的是MMLV（鼠源的）和AMV（禽源的）两种，现在更有各家公司推出的耐热的（50-60度）、超长片段的逆转录酶，这方面具有专长的数gibco（现在并购于invitrogen）。
我们实验室使用的一般是MMLV，鼠源的酶，虽然活性比较低一点，但是对应的RNaseH 活性也很低，在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。
对于从细胞培养物中利用RT-PCR方法扩增mRNA丰度低的基因也很有效。
但是AMV也有其自身的优点，酶的活性很高，扩增1kb以下的基因时比较常用，我知道临床上血液检测中有时使用AMV，省时，也省试剂。
简述RT-PCR的原理及应用
简述RT-PCR的原理及应用1. RT-PCR的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成DNA并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增的技术。
它结合了逆转录反应（RT）和PCR技术，能够从RNA分子中扩增出目标序列的DNA片段。
RT-PCR的原理可以分为以下几个步骤： - 逆转录反应：在逆转录酶（RT酶）的作用下，将RNA模板反转录成单链cDNA（互补DNA）。
- 第一链合成：通过加入一条适配器序列，形成一条新的DNA链，并使其保持单链状态。
- 第二链合成：加入第二个引物，依靠DNA聚合酶进行DNA链的合成。
此时，所得到的双链cDNA与原始RNA分子完全互补。
这样，通过逆转录和扩增两个步骤，我们可以从RNA模板中获得目标序列的DNA片断。
接下来，这些DNA片段可以通过PCR技术进一步扩增，以获取更多目标DNA。
2. RT-PCR的应用RT-PCR技术具有广泛的应用范围，包括以下几个方面：2.1 基因表达分析RT-PCR广泛应用于基因表达分析领域，其敏感性、特异性和快速性使其成为研究基因表达的重要工具。
通过从细胞中提取RNA，然后经过逆转录反应合成cDNA，最后通过扩增PCR得到目标基因的片段，可以定量分析目标基因在不同条件或组织中的表达水平。
2.2 病毒检测与诊断RT-PCR技术在病毒检测和诊断方面具有重要的应用价值。
病毒RNA是RT-PCR的理想模板，通过逆转录和扩增，可以检测病毒的存在和数量。
例如，在COVID-19大流行期间，RT-PCR被广泛用于检测冠状病毒的RNA，以诊断感染者和筛查潜在的传播者。
2.3 遗传疾病筛查RT-PCR也被广泛用于遗传疾病的筛查，特别是单基因遗传病的检测。
通过RT-PCR扩增目标基因的DNA片段，可以鉴定致病基因的突变。
这对于帮助家族中可能患有遗传病的个体进行早期诊断和咨询是非常重要的。
RT-PCR实验方法总结大全
RT-PCR实验方法总结大全第一篇：RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE 我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。
实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。
通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。
材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。
2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。
3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。
4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。
结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。
实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。
例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。
这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。
这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。
进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。
结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。
实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。
这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。
RT-PCR实验心得
RT-PCR实验心得■提取RNA(我做细胞的)1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后加2mlTRIzo l（量大无防！）,细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个1.5EP管中.2.颠倒摇晃10下，室温5分钟.3.在2个EP管中各加入0.2 ml氯仿。
盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。
4.在2—8°C下用不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。
离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。
5.用移液枪分别转上层水相（约500-600μl）于另二个1.5mlEP管中,加等体积异丙醇（约500-600μl），混匀室温10分钟来沉淀RN A→在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。
注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
6.舍弃上清,用75%的乙醇(用DEPC水处理的,临时十分钟配,预冷保存于4°C或-20°C) 1 ml来洗涤RNA沉淀→在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。
;离心前注意放管的方向,注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年!7 弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥）,用20-50μl DEPC水溶解。
(建议装于0.6的EP管中.)8紫外光度检测注:该步后,可保存于-70℃超低温冰箱,或算好计量建立体系立即用于逆转录.■ RT反应体系注意事项1.RT试剂盒中试剂解冻后,摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作.2 PCR仪预热到50°C,在放PCR管于PCR仪上(之前在冰上!)开始逆转录.3反应体系准备:比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物,在分装于PCR管中(分装前宜离心!),再分别加 RNA和引物/内参;4 RNA的量宜大2ug/reaction!5 要有要有逆转录(50℃,30min)和初始热活化(95℃, 15 min);反应体系要搞清!//(-)5'-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3'扩增片段长度为407bpGAPDH条件为预变性94℃ 3 min，94℃ 40 s、59度40 s、72度1 min 7个循环，94℃ 40 s、56度40 s、72度1 min 25个循环，72℃延伸5 min。
rt pcr实验报告
rt pcr实验报告RT-PCR实验报告引言：RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量RNA的表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR方法分析目标基因在不同组织和条件下的表达情况，从而深入了解其功能和调控机制。
材料与方法：1. 细胞或组织样本：选择不同类型的细胞或组织样本，如肝脏、肺、肌肉等。
2. RNA提取试剂盒：使用RNA提取试剂盒提取样本中的总RNA。
3. 逆转录试剂盒：使用逆转录试剂盒将RNA转录为cDNA。
4. PCR试剂盒：使用PCR试剂盒进行聚合酶链式反应。
5. 热循环仪：使用热循环仪进行PCR反应。
实验步骤：1. 样本处理：将细胞或组织样本收集并保存在合适的条件下，以保持RNA的完整性。
2. RNA提取：按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取样本中的总RNA。
3. RNA浓度和纯度检测：使用紫外-可见光分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保提取到高质量的RNA。
4. 逆转录反应：按照逆转录试剂盒的说明书进行操作，将RNA转录为cDNA。
5. PCR反应：按照PCR试剂盒的说明书进行操作，设置合适的引物和反应条件，进行PCR反应。
6. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
7. 凝胶图像分析：使用凝胶图像分析软件测量PCR产物的带的强度，并进行定量分析。
结果与讨论：通过RT-PCR实验，我们成功地分析了目标基因在不同组织和条件下的表达情况。
以下是实验结果的一些典型示例：1. 基因在不同组织中的表达差异：我们选择了肝脏、肺和肌肉作为研究对象，分别提取了这些组织中的总RNA，并进行了RT-PCR分析。
结果显示，目标基因在肝脏中的表达水平最高，肺次之，肌肉最低。
这表明目标基因在不同组织中的表达存在差异，可能与其功能和组织特异性有关。
2. 基因在不同条件下的表达调控：我们进一步研究了目标基因在不同条件下的表达调控。
一,RTPCR的基本知识
一、RT—PCR的原理逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR 进行DNA扩增。
RT-PCR的整体过程：首先由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
二、常用RT-PCR定量分析的方法1、实时荧光PCR（Quantitative Real-time PCR）实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在荧光信号中常用的荧光物质分为两种物质，荧光探针和荧光染料(1)SYBRGreenⅠ荧光染料法在RT-PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
这种方法可以用已知浓度的稳定核酸的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量。
标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
在标准曲线和未知样品反应过程中，通过荧光染料将产物标记，用相应的仪器随着反应的进行记录实验的实时结果。
(2).TaqMan探针法探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
自己总结：透彻易懂pcr rt-pcr原理【最新】
自己总结：透彻易懂pcr rt-pcr原理【最新】PCR原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
PCR这项技术，被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定。
DNA 变性DNA denaturation : 加热或用碱处理双链DNA，使氢链断裂，结果DNA变成为单链，此称为DNA的变性。
发生这种变化时的温度称为融解温度，鸟嘌呤和胞嘧啶含量高的DNA融解温度也高。
由于变性的结果DNA的紫外线吸收增加，比旋光度和粘度降低，密度也增加。
如果在加热后慢慢冷却，则DNA可以再次恢复成双螺旋结构。
另外，外部压力也能使DNA变性.PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95?高温时变性会变成单链，低温(经常是60?C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72?C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
引物(primer)，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。
DNA聚合酶(DNApolymerase)是细胞复制DNA的重要作用酶。
DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。
dNTP: deoxy-ribonucleoside triphosphate(三磷酸脱氧核糖核苷)的缩写。
半定量RT-PCR试验心得
半定量RT-PCR小结（一）试验原理半定量PCR是用于确定目的基因mRNA表达的量，通常以一个管家基因作为参照，传统的方法是将RNA逆转录获得cDNA，然后使用等量的cDNA作为PCR模板，用特异引物进行扩增得到目的基因和管家基因的片段，由于不同组织或细胞等来源的目的基因表达量不同，在同一个PCR体系条件下扩增得到的产物不同，而管家基因的表达则相同（理论上，实际可能在不同组织，细胞周期或者外界因素如药物处理后也会有差异），然后使用灰度扫描软件（如Totallab 或Bandscan）对目的基因的扩增条带进行灰度扫描，得到各条带的灰度，经过内参矫正后，得到一个相对值。
用凝胶成像系统自带的分析软件分析目的条带和内参照的平均密度值，也称为灰度值。
用目的条带的平均密度值除以内参照的平均密度值，即所需要的RATIO，看density 与area 的乘积。
而两个基因可以进行同管扩增，有时无法同管扩增，则分管扩增。
同一次实验中，这个相对值理论上与其对应RNA的量成正比。
这个方法是比较粗糙的，结果也受多方面的影响，可信度并不高。
如果有条件的话建议做Northern blot 或Realtime PCR。
首先要保证PCR过程处在它对数期，第二要保证每管扩增的效率相同，第三电泳点样、凝胶成像的分辨率等等。
与经典的检测基因的表达方法如Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及S1 核酸酶分析等相比,半定量RT-PCR 法具有灵敏度高(比杂交法高1 000～10 000 倍) 、专一性好、快速简便、所需样品量少及耗费较低等诸多优点。
然而,已有的研究表明,由于用半定量RT-PCR 法分析基因表达水平的影响因素较多,导致该法目前只能用于粗略比较样品间的基因表达水平。
（二）试验步骤<1>总RNA抽提总RNA提取时，根据大鼠发育时期及总RNA量，研磨小脑组织加入适量Sol D；总RNA沉淀过夜后，用适量Sol D重悬并加入等体积异丙醇保存于-80度；<2>模板cDNA制备取出总RNA用于制备cDNA时，可以根据EP管内沉淀量判断总RNA量的多寡，视反应需要沉淀适合体积总RNA，如果沉淀量较多，一般吸取100 ul其内即含数ug 总RNA即可进行一两个反转录反应；多余的总RNA重悬加入适量Sol D重悬并加入等体积异丙醇保存于-80度；注：RT反应体系为Takara公司推荐体系，本次RT-PCR试验中，由于天气热/冰箱有点问题、试剂盒用了许久，造成其中的dNTP、酶、oligoDT降解严重，以至于严重地影响试验进行；王老师让我将dNTP、酶、oligoDT的反应量均增加为原来的1.5倍；这样使总RNA 能更充分地用于反转录为cDNA。
实验篇之RT-PCR
实验篇之RT-PCR逆转录实验作为是常见的分子生物学实验之一，虽然看上去步骤简单，但当你实际操作时就会发现各种问题扑面而来，相信各位小伙伴都有被一个简单的逆转录实验搞得头晕眼花的时候，今天就由小编给大家介绍一下逆转录实验中的注意事项和常见问题，希望大家学以致用哦！图1 逆转录过程逆转录（reverse transcription）是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：1. 引物：逆转录引物主要有3种，包括Oligo（dT）、Random Primers 和基因特异性引物（GSP）。
其中Oligo（dT）具有12-20个 T 碱基，并且与真核生物 mRNA 的3’Poly A 尾配对，可合成全长的cDNA，但仅扩增有polyA 尾的mRNA ，对模板质量要求高，较适合克隆实验。
而 Random Primers 具有6-9个碱基，可随机识别模板并结合，适合复杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续qPCR 实验。
基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。
所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。
2. 逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNaseH 活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3，在高反应温度时可消除mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。
另一种来源于鼠白血病病毒（M-MLV），是单肽链的，有RNA 聚合酶活性和相对较弱的RNaseH 活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的 RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。
RTPCR实验方法总结大全
RTPCR实验方法总结大全.docRT-PCR实验方法总结大全引言逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）是一种分子生物学技术，它结合了逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）和聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）两种方法，用于从RNA模板中合成cDNA并进行扩增。
RT-PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、克隆和基因功能研究等领域。
实验原理逆转录: 逆转录酶将RNA模板转录成cDNA。
PCR扩增: 利用特定的引物对cDNA进行特异性扩增。
实验流程1. 样本准备收集样本，如细胞、组织或血液。
提取RNA，确保纯度和完整性。
2. 逆转录设计并合成特异性的逆转录引物。
将RNA与逆转录引物混合，加入逆转录酶。
在特定温度下进行逆转录反应。
3. PCR扩增设计并合成特异性的PCR引物。
将cDNA与PCR引物、聚合酶、dNTPs等反应体系混合。
进行PCR循环，包括变性、退火和延伸。
4. 结果分析通过凝胶电泳或实时定量PCR（qPCR）分析PCR产物。
根据条带大小或荧光信号判断扩增效果。
实验关键点引物设计引物应具有特异性，避免非特异性扩增。
引物长度通常为18-25个核苷酸。
避免引物二聚体和发夹结构。
逆转录酶的选择选择高保真度和高效率的逆转录酶。
考虑逆转录酶的热稳定性。
反应条件优化优化逆转录和PCR反应的温度、时间和循环次数。
调整反应体系中的Mg2+浓度。
避免污染使用无菌技术操作。
使用负对照和正对照验证实验结果。
数据分析使用适当的软件分析qPCR数据。
通过凝胶电泳分析PCR产物的特异性。
常见问题与解决方案1. 非特异性扩增优化引物设计。
调整Mg2+浓度。
减少循环次数。
2. 低效率逆转录检查RNA质量和完整性。
更换逆转录酶。
3. PCR产物不清晰优化PCR条件。
RT-PCR
real time PCR个人经验总结2009年的下半年我一直在跟RNA提取、逆转录和SYBR GREEN realtime-PCR反应做斗争，现在已经告别当初的迷茫，当别人问自己的时候，也能说出个一二五来了，很高兴。
当时在我艰难摸索的时候就想，等我都学会了，我一定要写篇帖子，把一个初学者最初的想法和觉得矛盾、困难、不知如何入手的方法、难点和最后解决的办法写出来，一来可以帮助更多像我这样的人，二来也算让自己有点成就感了，三就是希望版主给我加点分数了。
呵呵。
好了，现在开始吧。
1. ABI7000的仪器如何做溶解曲线：我们单位刚开始的时候只有一台仪器ABI7000，其他人都是用taqman探针做的，而且只是对结果进行定性分析。
我用的是SYBR green 染料，是需要做溶解曲线的，关于设置的问题就来了，设置好PCR的程序以后，在程序下方有一个框框，具体我忘了，把那个框框打上勾就好了,溶解曲线的温度是不能高于60的，所以我的有部分产物解链温度太高了，出来的溶解曲线只能出来半侧峰或者没有峰。
后来单位又购进了一台ROCHE 480 lightcycleR能设置溶解曲线的反应程序，这个问题就解决了。
2. 阈值的调整：一般设在最大荧光信号的1/5,或是R2最大时的CT值为阈值标准，根据不同的仪器选择。
3. 扩增效率的问题：lightcycle扩增效率在1.9-2.05之间认为结果是可以应用的，有可比性。
其它仪器是90-105%，因为我没用过其它的仪器，有见过这种仪器类型的网友可以补充一下。
4. realtime pcr的重复性问题：通常相同试剂、相同模版、同一个反映条件CT 不要相差一个循环以外。
比如复孔。
5. 梯度稀释问题：将模版10倍稀释后，每个梯度CT值相差要控制在3.3-3.5个循环之间。
如果CT值超过30个循环以后，就不适宜做梯度稀释了，因为这个时候浓度太低，定量本来就不准，所以梯度稀释结果不能用作参考的。
RT-PCR个人总结
RT- PCR相关知识及操作的总结RT-PCR(Realtime Polymerase Chain Reaction)即实时定量PCR。
实时监测，由于PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以称为定量的依据。
与常规PCR相比，RT-PCR的优点：实时监测（在对数扩增时期）而不是终点检测；敏感度高；需要样品少；特异性高；精确定量。
一、RT-PCR的反应条件1.反应液（1）模板单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
DNA模板一般100ng /100μL。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度0.1-0.5 μmol/L。
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
（引物设计：a序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列；b引物长度以15-40 bp为宜；c碱基尽可能随机分布,G+C 占40-60%；d引物内部避免形成二级结构；e两引物间避免有互补序列；f引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
）（3）Taq DNA聚合酶0.5-2.5 U/50 μl。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（4）dNTP（10mM or 2.5mM ）含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP ；dNTP浓度取决于扩增片段的长度；浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
浓度为0.5-2.5mmol/L。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
目前，市场上有各种试剂盒，可按其protocol进行添加。
2.循环参数（1）变性使双链DNA解链为单链； 94℃， 30-60秒(2) 退火温度由引物长度和GC含量决定。
实验六_RT-PCR(扩增)
过氧化物酶体增殖体激活受体（PPAR）属于核激素受体超家族成员， 过氧化物酶体增殖体激活受体（PPAR）属于核激素受体超家族成员，是类固醇 /甲状腺/维甲酸受体一种，该受体调控多种脂类代谢关键基因的表达，广泛参与脂 甲状腺/维甲酸受体一种，该受体调控多种脂类代谢关键基因的表达， 肪的吸收、运输、生成、分解（ 氧化和ω氧化），是调控脂类代谢的重要因子。 ），是调控脂类代谢的重要因子 肪的吸收、运输、生成、分解（β氧化和ω氧化），是调控脂类代谢的重要因子。 PPAR有 三种亚型，其中PPARα主要在肝脏中表达。PPARa被激活后可 PPARα主要在肝脏中表达 PPAR有α、β和γ三种亚型，其中PPARα主要在肝脏中表达。PPARa被激活后可 在多个水平上增加脂肪酸的分解，PPARa与其配体结合后， 在多个水平上增加脂肪酸的分解，PPARa与其配体结合后，能增加肝脏的脂肪酸转运 与其配体结合后 蛋白、脂肪酸移位酶、乙酰辅酶A合成酶的表达、促进肝的脂肪酸摄取； 蛋白、脂肪酸移位酶、乙酰辅酶A合成酶的表达、促进肝的脂肪酸摄取；影响脂肪酸 和胆固醇在血浆中的转运；增加载脂蛋白AI、 AII的转录 的转录， 和胆固醇在血浆中的转运；增加载脂蛋白AI、 AII的转录，水解富含甘油三酯的极 AI 低密度脂蛋白(VLDL)。 低密度脂蛋白(VLDL)。 (VLDL)
5min
94 ℃
30s
55 ℃
30s
72 ℃
1min 72 ℃
10min
4 ℃
1h
34 Cycle
反应结束后，向每管中加入3uL溴酚兰，混匀， 18uL进行琼脂糖凝胶电泳 3uL溴酚兰 进行琼脂糖凝胶电泳。 反应结束后，向每管中加入3uL溴酚兰，混匀，取18uL进行琼脂糖凝胶电泳。
四 实验结果
RTPCR常见问题分析
10.PCR引物设 计较差
避免在引物3'端含有互 补序列。避免可以形 成内部发卡结构的序 列。设计Tm类似的引 物。最佳引物浓度介 于0.1μM到0.5μM之间。 为了精确确定引物浓 度，在260nm测量光 密度，然后使用光吸 收值和消光系数计算 浓度。
5. 多糖同RNA 共沉淀
增加RNA量;对于 <50ng的RNA样品， 可以在第一链cDNA合 成中使用0.1μg到 0.5μg乙酰BSA;
使用氯化锂沉淀RNA 以除去多糖;
6.RNA模板 二级结构太多
将RNA和引物在不含盐及 缓冲液条件下变性/退火;
提高逆转录反应温度，对 SuperScriptⅡ可以到50℃， 对 ThermoScript可以到 65℃。注意：不要在 >60℃时使用oligo(dT)引 物，选择一个在反应温度 可以退火的GSP;对于
4.形成引物二 聚体
5.镁离子浓度 太高
6.沾染外源 DNA
设计在3’端没有互补 序列的引物。
对于每一个模板和引 物组化优化镁离子浓 度。
使用抗气雾剂和UDG 酶。
问题三：产生弥散条带
原因
1.cDNA第一链产物的含 量过高 2. DNase降解DNA产生的 寡核苷酸的非特异性 扩增 3. PCR反应中引物过多 4. 循环数过多 5. 退火温度过低
有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了 高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少 稀释100倍再进行二次扩增。
另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物 的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行 热启动以提高特异性
使用公式估算Tm，把 退火温度设定为低于 Tm 5℃。因为这些公 式只是估算Tm值，所 有真正的退火温度实 际会高些或低些。
半定量RT-PCR试验心得
1、抽提出高质量的RNA。
要求：实验器材和用品做好抑制RNA 酶
准备；操作过程中避免RNA酶污染；提取的组织细胞样品不能太多（可能裂解不充分等）。
2、选用高质量的RT酶。
女口Promega Invitrogen公司等。
3、引物设计正确。
尤其注意动物种属、至少包含1个内含子、参
考文献的质量等。
4、P CR扩增中循环次数恰当。
过少的循环次数条带出不来，过高的
循环次数条带太亮看不出差异（达到平台期后也不准确）。
5、M g2+浓度和Taq酶含量适度。
过高容易引起非特异性条带。
6、建议在RT逆转录前可以对样品进行DNA酶处理，以纯化提取
的样品RNA。
7、图像定量分析时尽量选择浅条带，太亮的条带不可靠。
我在做半定量Rt-Pcr如下图。
跑出来发现平行样的亮度差异颇大。
实验设计：
共有4个cDNA的样本,分别命名为A,B,C,D，检测其中某基因表达的差异。
为了准确每个样本设3个平行样，也就是说A1, A2 ,A3均是从同一管（A管）取等量的（3UL）cDNA，加入同样的反应系统（先配好反应系统再分装到各per管中），用同一次per反应跑出来的。
发现平行样的亮度差异颇大。
尤其是A和C系列，几乎相差两倍。
请问各位大侠，PCR中平行样的误差真有这么大吗？？还是我的操
作有问题？？
请各位大侠帮忙
我用的是50ul的反映系统，条件是：94 C 30秒，55 C 60秒, 72 °C 60 秒。
25次循环。
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RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PC R的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR 太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。
问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。
虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。
请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. i t just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettr er for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control o f housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。
Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。
能看到均一条带就很好了。
关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先要分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。
有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。
不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。
2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和t aq。
关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。
看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。
我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。
烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。
给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。
引物当然要设计成一样的退火温度，即使不在一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。
我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RN A为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。
18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。
我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。
更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。
因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。
后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。
尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问：1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm 值吗？2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单上的是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.一、防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。