降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备

降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备
郑姣;刘如石;邱义兰;廖晶;李晓丹;张坚松;吴意;何赛;梁湘辉;郭向荣
【摘要】Purpose:Recombinant human PCT was efficiently expressed in E.coli,and was purified,and then the high-ly sensitive and specific monoclonal antibodies (mAb)against PCT were prepared,which can be used as diagnostic raw materials for infectious diseases.Method:The recombinant PCT was purified with saturated ammonium sulfate precipita-tion and affinity chromatography method,and then the recombinant protein was confirmed by mass spectrometry.West-ern blot and indirect ELISA assay was used to detect the immunoreactivity of the recombinant protein.The mice were im-munized with the recombinant protein,and anti-PCT monoclonal antibodies (mAb)were prepared by cell fusion andscreening.Result:The recombinant protein was the human procalcitonin,which had good immunoreacitvity and immu-nogenicity,and 7 monoclonal antibodies against human PCT were obtained,and ELISA indicated the antibodies had a good specificity and sensitivity to PCT antigen.Conclusion:Highly sensitive and specific anti-PCT monoclonal antibody was prepared for recombinant human PCT,which will provide a raw material for the development of PCT rapid diagnostic reagent.%目的：高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白，制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体。

方法：大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后，利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后，经质谱、Western blot和间接 ELISA法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性；重组蛋白免疫小鼠，经细胞融合及
筛选制备抗PCT单克隆抗体（mAb）。

结果：在大肠杆菌中高效表达了人PCT蛋白；重组人PCT蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性；经筛选获得7株抗PCT 单克隆抗体细胞株，经ELISA鉴定，筛选抗体可与PCT抗原有良好的特异性反应。

结论：利用重组人PCT蛋白免疫制备了抗人PCT单克隆抗体，为进一步研发PCT 快速诊断试剂提供了原料。

【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2016(025)002
【总页数】9页(P147-155)
【关键词】降钙素原;原核表达;酶联免疫吸附 (ELISA);纯化;单克隆抗体 (mAb)
【作者】郑姣;刘如石;邱义兰;廖晶;李晓丹;张坚松;吴意;何赛;梁湘辉;郭向荣
【作者单位】湖南师范大学医学院，湖南长沙410013; 湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙410013;湖南师范大学医学院，湖南长沙410013;湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙410013;湖南师范大学医学院，湖南长沙410013;湖南师
范大学医学院，湖南长沙410013;湖南师范大学医学院，湖南长沙410013;湖南师范大学第一附属医院，湖南长沙410013;湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙410013;中南大学湘雅医院，湖南长沙410008;湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙410013
【正文语种】中文
【中图分类】R392
降钙素原(procalcitonin, PCT)是降钙素(calcitonin, CT)的前肽物，无激素活性，
由116个氨基酸组成，相对分子质量约为13 kD的糖蛋白。

在空间结构上，通过
生物信息学软件预测有三种可能的空间结构(图1)。

PCT半衰期为20～24 h，在
体内外稳定性很好。

在正常生理情况下，健康人血液中PCT含量通常极低，小于0.10 ng/mL[1]。

当出现严重真菌、细菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，血清中PCT的含量会迅速升高，甚至会蹿升至正常情况下的5 000倍[2]。

但过敏和病毒感染以及自身性免疫疾病不会引起血清中PCT升高，局部细菌感染
和慢性炎症同样不会导致血清PCT水平的明显变化[3,4]。

且在败血症、脓毒血症
等疾病中，PCT是一种非常敏感的特异性诊断标志物，并可反映其严重程度[5,6]。

在全身性炎症反应时，PCT较CRP、IL-6等其它炎症因子而言，窗口期短，约2
h后可监测到，而且PCT增长快速，12～48 h达到峰值，这在早期检测中具有明显的优势[7]。

近年来还发现，PCT与常用的血培养、CRP、IL-6等感染指标比较，具有一定的优越性，其可以监测疾病治疗的效果，指导抗生素的应用，并减少临床非必需抗生素的使用和抗生素的使用时间，降低细菌耐药率和不良反应发生率[8,9]。

此外，PCT半衰期较长，能在一段时间内维持在高水平，之后其含量随着
病情恢复逐渐下降，且恢复至正常水平所需时间比CRP短，这有利于快速反映治
疗效果。

随着不断深入的研究和大量临床资料的积累，PCT测定现已广泛应用于
临床感染性疾病的诊断和疗效判断，也可用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、新生儿监护室、外科、内科和器官移植科等[10,11]。

在感染性临床诊断和治疗中，传统检测指标如体温、白细胞计数(WBC)和CRP的
灵敏性和特异性均不高[12]，而PCT与过去的生物学标记物相比，具有较理想的
准确性和特异性[13]。

因此，PCT水平的检测有助于临床的早期诊断和制定合理的治疗方案。

尽管目前我国对PCT的研究做了很多工作，其作为一种感染标志物已得到临床的
普遍重视与认可，但大部分研究集中于PCT的临床应用观察[14,15]。

目前使用的PCT试剂部分由国外进口，价格昂贵[16]；国内也有相关PCT的检测产品，但其
检测关键原料在一定程度上仍依赖进口，本实验通过重组表达纯化PCT并制备单克隆抗体，为PCT的基础研究和下一步研发低成本快速诊断试剂提供重要材料。

1.1 材料
1.1.1 动物和细胞株
BALB/c小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；降钙素原表达质粒由厦门大学夏宁邵教授惠赠；大肠杆菌E.coli Top10F′、ER2566菌株由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂
HRP-羊抗鼠二抗由厦门大学夏宁邵教授惠赠，抗PCT多克隆抗体购于Proteintech公司，质粒提取试剂盒、Ni-IDA Resin和胎牛血清购自上海生工生物工程股份有限公司，蛋白质相对分子质量标准购自Thermo公司，HRP-DAB
底物显色试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司，HT和HAT以及弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂为美国Sigma公司产品。

1.2 方法
1.2.1 目的蛋白小量表达与活性鉴定
先将PCT表达质粒转化到ER2566感受态细胞中，再接种PCT的阳性菌株到3 mL Kn+LB液体培养基中37 ℃培养至OD600值约为0.6时，加入IPTG至终浓度为200 μg/mL进行诱导表达，同时以加IPTG诱导的转化空母体质粒菌株作为阴性对照，其它培养条件均一致，然后37 ℃诱导培养4 h，室温12 000 g离心1 min收集菌体，制备蛋白样品进行12%的SDS-PAGE电泳。

切取SDS-PAGE上表达重组蛋白，进行质谱鉴定。

1.2.2 重组蛋白的质谱鉴定
重组蛋白经消化、酶解[17]后经由德国Bruker公司的电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱MicroTOFQ-Ⅱ进行质谱分析，配备戴安公司UltriMate 3000毛细管液相
色谱仪(Nano LC)和纳升(Nano)喷雾源，所有分析都在正离子模式下进行。

雾化
气为氮气，碰撞气为氩气，温源150 ℃，锥孔电压为1 200 V。

仪器的MS和
MS/MS的转换通过microTOF control 3.0软件自动进行。

样品经过C18预柱(5 mm×320 μm)脱盐和浓缩后，经过5%-40%的乙腈乙酸液(乙晴∶乙酸体积比为1∶1)梯度洗脱C18毛细管柱进行肽段分离，流速为300 nL/min。

分离肽段直接
进入离子源。

一次选择三个最大强度的肽段进行MS/MS分析，获得的数据输入
数据库(NCBInr)，使用Mascot软件(Matrix Science Ltd.，UK)中的串联质谱数
据库搜索功能进行搜索。

1.2.3 重组蛋白的大量表达与鉴定
将重组表达菌株接种到50 mL LB(Kn+)培养基中培养12 h，然后以2%(V/V)的比例接种至1 L Kn+LB液体培养基中培养。

待菌液OD600值达到0.6，加入IPTG
至终浓度为200 μg/mL 37 ℃进行诱导表达4 h后，12 000 g离心8 min收集菌体。

加入50 mL裂解液(50 mmol/L Tris·HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)，Ф10 mm 探头200 W功率超声破碎细胞。

12 000 g离心10 min，分别收集上清和沉淀制成蛋白样品，通过SDS-PAGE鉴定PCT蛋白在大肠杆菌细胞中的表达方式。

1.2.4 重组蛋白的纯化
将上清转移到烧杯，按公式V3=V*(100-Q1)/(Q1-Q2)(V代表上清体积；Q1代表此次的硫浓度；Q2代表前一次硫浓度；V3代表加入的饱和硫酸铵体积)缓慢滴入
饱和硫酸铵(pH 7.4)，在冰上搅拌30 min，4 ℃静置2 h，然后4 ℃，12 000 g，离心10 min，用PBS(pH 7.4)将沉淀溶解。

依次进行20%、30%、40%、50%、60%五个梯度硫酸铵盐析纯化重组PCT蛋白，收集样品进行SDS-PAGE鉴定。

用5到10倍柱体积的buffer 0(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，
pH 8.0)以1 mL/min的速度平衡Ni-IDA柱。

PBS溶解的重组PCT蛋白上样于
Ni-IDA，然后用buffer 0过柱，再依次用buffer 0配制的20、50、100、250 mM的咪唑梯度洗脱重组蛋白，流速为1 mL/min。

洗脱液于4 ℃用PBS(pH 7.4)透析去除咪唑，收集样品SDS-PAGE鉴定。

以0.5 mL/min的流速用10倍柱床体积的流动相PBS(pH 7.0)平衡TSK-GEL
G3000 SW层析柱至280 nm吸收值无明显变化，将检测器吸收值归零，然后加
入咪唑洗脱透析后的蛋白样2 mL，以0.5 mL/min的流速进行分子筛层析，收集280 nm处吸收值大于0.5 AU 的蛋白峰，SDS-PAGE和Western blot分析鉴定
收集的蛋白峰。

1.2.5 间接ELISA检测重组蛋白的免疫反应性
将纯化后的重组蛋白用CB稀释液(15 mmol/L Na2CO3、35 mmol/L NaHCO3)稀释至浓度为0.5 mg/L，然后包被到ELISA用96孔板，4 ℃过夜；洗板1次后，加入200 μL ED封闭液，37 ℃放置2 h；洗板5次，加入1∶2 000比例稀释的
抗PCT多克隆抗体，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入HRP-羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min；洗板5次，最后加入TMB底物显色剂，37 ℃反应10 min，加入
终止液终止反应，最后双波长(450 nm/630 nm)进行检测。

1.2.6 PCT重组蛋白动物免疫
将纯化后的PCT蛋白用PBS缓冲液透析后，稀释至1 mg/mL，按每只小鼠30
μg、50 μg、100 μg和150 μg四个剂量，然后分别按1∶1加入弗氏完全佐剂充分乳化。

采用皮下多点免疫的方法，进行初次免疫，每个剂量免疫3只小鼠。

两
周后，进行加强免疫时，1∶1加入蛋白溶液和弗式不完全佐剂，充分乳化后以同
样剂量免疫小鼠。

共进行2次加强免疫，每次间隔2周，每次免疫前一天收集小
鼠血清进行间接ELISA，以检测PCT重组蛋白的免疫原性及血清抗体效价。

第三
次免疫8 d后，小鼠尾静脉采血，4 ℃，4 000 g离心5 min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价最高的小鼠，在融合前4 d进行脾脏加强免
疫，剂量为每只小鼠50 μg PCT蛋白，2 d后尾静脉注射20 μg蛋白。

1.2.7 细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆及亚型鉴定
将生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞分别用无血清1640
培养基洗涤至没有大颗粒沉淀后，以1∶5～1∶10混合，1 200 g离心1 min，弃上清。

轻摇离心管使细胞均匀分散后，缓缓加入1 mL 37 ℃预热的PEG 1 500并轻轻吹打混匀，60 s后，立即加入预热的20 mL 1640培养基终止融合，然后加
入20% FBS-HAT-1640培养基悬浮细胞并混匀。

将混匀后的培养基均匀铺于96孔板中，置于5% CO2，37 ℃的培养箱中培养，
每天跟踪观察，融合后7～10 d用10% FBS-HT-1640培养液换液，当克隆长至
孔底面积的1/3～1/2时，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液抗体效价，通过有限稀释法对阳性值高且细胞集落数目少的孔进行克隆化。

经过4次亚克隆后，即得到能稳定分泌特异性的阳性单克隆细胞株，然后转移至24孔细胞培养板中扩大培养，再取细胞上清进行亚型鉴定。

1.2.8 单克隆抗体的纯化与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，先腹腔注射无菌石蜡油，每只0.5 mL。

7 d后向腹腔内注入杂交瘤细胞，调整细胞密度为1×106-2×106 /mL，每只小鼠大约注射0.5 mL。

8-10 d后即开始采集腹水。

将采集好的腹水1∶1(V/V)缓慢加入饱和硫酸铵，冰上搅拌30 min，4 ℃，12 000 g离心10 min后弃上清。

沉淀用一定体积的PBS溶解，移至透析袋中透析平衡至20倍体积的Binding buffer(Protein A Sefinose Kit中提供)中以除去高浓度的离子，然后用蛋白A柱纯化。

将纯化前与
纯化后的腹水抗体经SDS-PAGE电泳。

将纯化后的人重组PCT蛋白用CB稀释液(15 mmol/L Na2CO3、35 mmol/L NaHCO3)稀释至浓度为1 μg/mL，然后包被到ELISA用96孔板，37 ℃ 2 h；洗板1次后，加入200 μL ED封闭液，37 ℃放置2 h；洗板5次，加入1∶5 000
比例稀释的纯化后的抗PCT单克隆抗体，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入HRP-羊抗鼠二抗，37 ℃孵育30 min；洗板5次，最后加入TMB底物显色剂，37 ℃反应10 min，加入终止液终止反应，最后双波长(450 nm/630 nm)进行检测。

2.1 重组蛋白的诱导表达
将诱导的重组菌株和阴性对照组菌株制备蛋白样品进行SDS-PAGE，比较经IPTG 诱导的重组菌株的实验组和加IPTG诱导的转化空母体质粒菌株的对照组，结果显示，诱导后的PCT重组菌株表达了一大小约13 kD的蛋白条带(图2 lane 2 ～ 3)，而在对照组中没有出现这一条带(图2 lane 1)，而且表达蛋白相对分子质量与预期PCT蛋白大小一致，初步说明重组基因在大肠杆菌中获得了有效表达。

2.2 质谱法检测重组蛋白性质
重组蛋白电泳分离，胰酶消化后，再进行质谱仪分析，将得到的数据输入数据库进行匹配分析，结果显示检测蛋白与数据库中PCT蛋白高度一致(图3)。

软件分析结果显示，Protein score为282(表1)，结果可靠。

多肽的蛋白覆盖率达到40%，
同时也表明质谱分析结果可信度较高，质谱结果显示PCT重组蛋白的相对分子质
量约为15572D，与天然PCT蛋白的相对分子质量大小完全一致，这也进一步提
高了PCT重组蛋白的可信度。

2.3 重组蛋白表达方式鉴定及纯化
将细胞进行超声波破碎后，取少量悬液离心，分别收集上清和沉淀制成蛋白样品。

通过SDS-PAGE检测后，结果显示，目的蛋白主要分布在上清中(图4A lane 2)。

因此取表达菌株破碎后的细胞上清，先进行20%-60%的饱和硫酸铵沉淀的粗纯化，分别取样进行SDS-PAGE鉴定。

结果显示，重组蛋白主要沉淀在20%～30%的饱和硫酸铵中(图4B lane 2～3)。

PBS溶解后的PCT蛋白用Ni-IDA柱亲和层析纯化，SDS-PAGE显示PCT的纯度很高，只有较少的其它杂带(图6 lane 2～5)，为
进一步纯化PCT达到动物免疫抗原的要求，采用分子筛层析，收集保留时间为7～9 min的蛋白，进行SDS-PAGE。

结果发现，通过TSK-GEL G3000 SW层析柱纯化的PCT蛋白从SDS-PAGE上显示没有杂带，纯度很高(图6 lane 6和图7A lane 1)，达到电泳纯度，满足动物免疫的要求。

层析色谱图为图5，而且Western blot结果显示纯化后的PCT蛋白仍保持着较好的免疫反应性(图7B Lane 1)。

2.4 间接ELISA检测重组蛋白反应灵敏度
用0.5 μg/mL的PCT重组蛋白包被ELISA板，以PBS为对照，加入抗PCT多克隆抗体进行ELISA检测，结果显示，低浓度PCT可与抗体发生免疫反应，以阴性值的2.1倍设为临界值，结果表明该重组蛋白具有较高的反应灵敏度(表2)，该结果也进一步说明该重组抗原具有良好免疫反应性，而且具有作为检测抗PCT抗体的潜力，也可以用来制备检测抗PCT抗原的医用诊断单克隆抗体。

2.5 间接ELISA检测重组蛋白免疫原性
通过间接ELISA试验检测PCT免疫小鼠血清抗体效价，阴性对照为小鼠免疫前血清，以2.1倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值，小鼠在初次免疫后体内抗体水平较低，在第二次和第三次加强免疫后可以明显的发现血清阳性值上升较快，且差异有统计学意义(P<0.05)(图8)，说明PCT重组蛋白能在小鼠体内引起较强的免疫反应，作为抗原具有良好的免疫原性，在第三次免疫之后，百万倍稀释后血清中抗PCT抗体效价已高达1.0以上(图8)，此时已达到制备单克隆抗体的要求。

2.6 细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆及亚型鉴定
细胞融合后，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液抗PCT抗体效价，通过有限稀释法对阳性值高且细胞集落数目少的孔进行克隆化。

经过3～4次克隆化后，目前已获得了能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株7株，取细胞上清进行抗体亚型鉴定，将这些细胞株部分用于单克隆抗体的制备，部分于液氮罐内冻存。

亚型鉴定
结果显示为：7H8、2D3、7F9亚型为IgG1；8E12、4G9、8E6亚型为IgG2a；3F9亚型为IgG2b(图9)。

2.7 单克隆抗体的纯化与鉴定
SDS-PAGE鉴定纯化后的抗体，出现了三条带：50 kDa的重链、25 kDa的轻链和约 100 kDa大小的条带，但不煮沸时主要为100 kDa的条带，煮沸后重链条带明显变强，100 kDa的条带变弱，且大小是重链的两倍，煮沸前后轻链条带强弱相差不大(图10)，因此，100 kDa的条带为重链与重链的聚合体，原因是两条重链间的二硫键没有完全破坏。

从凝胶上看不到其它杂蛋白条带，这说明经亲和柱层析后，单克隆抗体达到了相当高的纯度，可以用于后续实验。

以纯化的人重组PCT为抗原，将7株纯化后的抗PCT单克隆抗体按1∶5 000稀释后进行间接ELISA检测，结果显示纯化后的7株单抗全为阳性(表3)。

PCT作为感染性疾病诊疗中用于协助早期诊断、监测用药及预后的一种全新炎性标志物，主要来源于甲状腺C细胞，受细菌毒素(LPS)及多种炎性细胞因子调节。

Assicot等首次发现脓毒血症患者血液中PCT含量明显升高，意味着PCT可作为炎症、脓毒血症等细菌感染病症的血清学标志物[18]。

而脓毒症会议在2000年认定PCT是对脓毒症的诊断、预后及监测性能最优异的生物标志物。

目前国内外PCT最新研究主要有：Klinikum rechts der Isar实验室与BRAHMS AG合作使用E 411电化学发光免疫分析仪，利用抗PCT单克隆抗体进行临床血清PCT的测定，结果显示灵敏度很高。

而Kremmer用夹心ELASA法检测PCT 的生物素化的抗PCT单克隆抗体，结果显示，与BRAHMS的电化学发光免疫测定方法相比，同一测定结果下，该实验所能检测到的PCT含量更低，即灵敏度更高[19]。

研究人员Wang等将所获得的抗PCT单克隆抗体配对，并建立双抗体夹心法，应用于临床检测，特异性高达96.64%；研发的抗体标记荧光胶乳后，进行免疫层析
平台配对成功，建立了荧光胶乳免疫层析方法，应用于临床检测，特异性可达到97.8%[20]；而且抗体用于电化学免疫检测方法，PCT的检测下限可达到0.5
pg/mL[21]。

目前临床中对PCT检测主要方法有荧光分析免疫法、胶体金法和电化学发光法等，这些方法的建立都依赖于高特异性和灵敏度的单克隆抗体，但抗PCT高特异性和
灵敏度的单克隆抗体的制备具有一定的难度，目前国内优质的单抗很大程度上依赖于进口，价格昂贵，限制了PCT检测在国内临床上的推广使用，而优质单抗的筛
选首先要获得高纯度和蛋白构象正确的PCT蛋白。

本研究利用大肠杆菌表达经过
密码子优化后的PCT序列，结果显示37 ℃诱导4 h即可获得可溶性高效表达，
经硫酸铵沉淀初步纯化后，用Ni-IDA柱进一步纯化，SDS-PAGE结果显示，仅有少量的杂蛋白，最后过分子筛层析纯化后，即可得到纯度99%以上的PCT蛋白，有利于后续单克隆抗体的制备与筛选。

本研究原核表达的人重组PCT蛋白序列为
依大肠杆菌密码子嗜性优化后全基因序列，囊括了根据生物信息学预测的所有的抗原表位，且可溶性表达能很好的模拟天然蛋白构象，刺激B细胞分泌多种不同表
位的抗体，为筛选特异性好、亲和力高、灵敏度高的抗体库提供了基础，同时也为诊断试剂的研制提供了很好的原材料。

本研究通过对动物免疫这一关键步骤的把握，保证了较好的阳性克隆率。

细胞融合后生长到孔底面积的1/2-1/3时进行亚克隆，避免发生阳性细胞漏检和染色体丢失的情况。

采用操作简便的有限稀释法，确保了杂交瘤细胞系的稳定性和抗体分泌效价高的特点。

经过4次克隆化，获得的杂交
瘤细胞阳性率均为100%。

得到的杂交瘤细胞株能稳定、高效分泌抗人PCT单克
隆抗体。

经过我们的初步评估，本研究制备的单克隆抗体的成功研发将打破对国外降钙素原单克隆抗体产品的依赖性，为开发优良的本土诊断试剂，降低诊断试剂的成本奠定了良好的基础。

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