心力衰竭大鼠心肌SERCA2a和m1R-25-3p5p表达的改变及泻肺利水方药的干预作用

【收稿日期】２０１６ ０４ １９【修回日期】２０１６ １１ ２１
△【通讯作者】Ｔｅｌ：０２０ ３６５９８９０９；Ｅ ｍａｉｌ：ｓｈａｏｘｉａｎｇｘ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
心力衰竭大鼠心肌ＳＥＲＣＡ２ａ和ｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐ表达的改变
及泻肺利水方药的干预作用
吴锦波１，２，叶小汉２，冼绍祥３△，董明国２
（１．广州中医药大学博士后流动站，广州５１０４０５；２．东莞市中医院心内科，东莞５２３０００
；３．广州中医药大学第一附属医院心内科，广州５１０４０５
）【摘要】目的：观察心力衰竭大鼠肌浆网钙ＡＴＰ酶（ＳＥＲＣＡ２ａ）ｍＲＮＡ和ｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐ表达水平的变化及中药泻肺利水方药的干预作用。

方法：ＳＤ大鼠随机分为对照组、模型组、中药组、卡托普利组和地高辛组（ｎ＝１０），阿霉素腹腔注射（总剂量１５ｍｌ／ｋｇ，２周内分６次注射）建立心力衰竭大鼠模型，５周后分别以蒸馏水（１０ｍｌ／（ｋｇ·ｄ））、泻肺利水中药（２２ｇ／（ｋｇ·ｄ））、卡托普利（１９ｍｇ／（ｋｇ·ｄ））和地高辛（３２μｇ／（ｋｇ·ｄ））连续灌胃３５ｄ，观察大鼠心肌ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ、ｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐ的表达水平和ＳＥＲＣＡ２ａ活性、血浆脑钠肽水平、心输出量和射血分数。

结果：模型组大鼠心输出量和射血分数显著降低，心肌ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ表达水平和活性降低，ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ的表达水平、血浆脑钠肽水平显著升高；泻肺利水中药能提高心肌ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ表达水平和活性，降低ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ的表达水平，降低血浆脑钠肽水平，提高心输出量和射血分数；卡托普利能提高心肌ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ表达水平，降低ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ的表达水平，降低血浆脑钠肽水平，提高心输出量；地高辛能提高心肌ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ表达水平，降低血清脑钠肽水平，提高心输出量。

结论：心力衰竭大鼠心肌ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ的表达下调，ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ的表达上调；泻肺利水方药可以上调ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ的表达，下调心肌ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ的表达，改善心功能。

【关键词】泻肺利水方药；心力衰竭；肌浆网钙ＡＴＰ酶；ｍｉＲＮＡ ２５；大鼠【中图分类号】Ｒ５４１．６；Ｒ２８９
【文献标识码】Ａ
【文章编号】１０００ ６８３４（２０１７）０２ １４６ ０５
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５４４９．２０１７．０３７
ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＳＥＲＣＡ２ａａｎｄｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐｉｎｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｏｆｒａｔｓｗｉｔｈ
ｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆＸｉｅｆｅｉＬｉｓｈｕｉｒｅｃｉｐｅ
ＷＵＪｉｎ ｂｏ１，２，ＹＥＸｉａｏ ｈａｎ２，ＸＩＡＮＳｈａｏ ｘｉａｎｇ３△，ＤＯＮＧＭｉｎｇ ｇｕｏ
２（１．Ｐｏｓｔ ｄｏｃｔｏｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｔａｔｉｏｎｏｆＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０４０５
；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＤｏｎｇｇｕａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｏｎｇｇｕａｎ５２３０００
；３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０４０５，Ｃｈｉｎａ
）【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｃａｌｃｉｕｍＡＴＰａｓｅ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）ｍＲＮＡａｎｄｍｉＲ ２５ ３ｐ／
５ｐｉｎｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｏｆｒａｔｓｗｉｔｈｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅａｎｄｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆＸｉｅｆｅｉＬｉｓｈｕｉｒｅｃｉｐｅ（ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｇｒｏｕｐ（ＴＣＭｇｒｏｕｐ），ｃａｐｔｏｐｒｉｌｇｒｏｕｐ
ａｎｄｄｉｇｏｘｉｎｇｒｏｕｐ（ｎ＝１０）．Ｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅｒａｔｍｏｄｅｌｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｏｆｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（６ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｉｎ２ｗｅｅｋｓ；ｔｏｔａｌｄｏｓｅ：１５ｍｇ／ｋｇ）．Ｆｉｖｅｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｈｅｆｉｒｓｔｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ（１０ｍｌ／（ｋｇ·ｄ）），ＴＣＭ（２２ｇ／（ｋｇ·ｄ）），ｃａｐｔｏｐｒｉｌ（１９ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）），ａｎｄ
ｄｉｇｏｘｉｎ（３２μｇ／（ｋｇ·ｄ））ｗｅｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄｂｙｇａｓｔｒｏｇａｖａｇｅｆｏｒ３５ｄａｙｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＭｙｏｃａｒｄｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡａｎｄｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ；ｍｙｏｃａｒｄｉａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＳＥＲＣＡ２ａｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ；ｃａｒｄｉａｃｏｕｔｐｕｔ（ＣＯ）ａｎｄｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ（ＬＶＥＦ）ａｎｄ
ｐｌａｓｍａｌｅｖｅｌｏｆＢ ｔｙｐｅｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ（ＢＮＰ）ｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＭｙｏｃａｒｄｉａｌｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＥＲＣＡ２ａｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙＴＣＭｏｒｃａｐｔｏｐｒｉｌｏｒｄｉｇｏｘｉｎ，ｗｈｉｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｍｉＲ ２５ ３ｐａｎｄ
ｍｉＲ ２５ ５ｐｉｎｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙＴＣＭｏｒｃａｐｔｏｐｒｉｌ．ＳＥＲＣＡ２ａａｃｔｉｖｉｔｙ，ＣＯａｎｄＬＶＥＦｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙＴＣＭ，ｗｈｉｌｅｐｌａｓｍａｌｅｖｅｌｏｆＢＮＰｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙＴＣＭｏｒｃａｐｔｏｐｒｉｌｏｒｄｉｇｏｘｉｎ．ＣＯｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅｃｏｕｌｄｂｅｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙｃａｐｔｏｐｒｉｌｏｒｄｉｇｏｘｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ，ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＥＲＣＡ２ａｗａｓｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ ２５ ３ｐａｎｄｍｉＲ ２５ ５ｐｉｎｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ．ＸｉｅｆｅｉＬｉｓｈｕｉｒｅｃｉｐｅｃａｎｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＳＥＲＣＡ２ａ，ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ ２５ ３ｐａｎｄｍｉＲ ２５ ５ｐｉｎｍｙｏｃａｒｄｉｕｍａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｃａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎ．【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】ＸｉｅｆｅｉＬｉｓｈｕｉｒｅｃｉｐｅ；ｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ，ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ；ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｃａｌｃｉｕｍＡＴＰａｓｅ；ｍｉＲＮＡ ２５；ｍｏｕｓｅ
６４１ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１７，３３（２
）
慢性心力衰竭（ｃｈｒｏｎｉｃｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ，ＣＨＦ），简称心衰，是多种心血管疾病的终末期表现，随着人口老年化和生活方式的改变，心衰的患病人数不断增加。

目前全球已超过３８００万［１］，给社会造成沉重的经济负担，已成为一个全球性的公共卫生问题。

尽管心衰治疗方案不断优化，但其５年病死率仍高达５０％［２］，因此有必要寻求更好的治疗方法。

心肌细胞内Ｃａ２＋稳态失衡是ＣＨＦ发生发展的关键环节，直接影响心肌细胞的收缩舒张功能，引发一系列Ｃａ２＋依赖的信号通路异常，导致心肌细胞结构和功能改变。

因此，纠正细胞内Ｃａ２＋稳态失衡是心衰治疗策略的研究热点［３］。

肌浆网钙ＡＴＰ酶２ａ（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｃａｌｃｉｕｍＡＴＰａｓｅ２ａ，ＳＥＲＣＡ２ａ）在舒张期重摄Ｃａ２＋进入肌浆网，以维持细胞内Ｃａ２＋稳态，调节心肌兴奋 收缩耦联；转ＳＥＲＣＡ２ａ基因治疗可以改善实验动物和ＣＨＦ患者的心功能［４］。

ｍｉＲ ２５可以降低ＳＥＲＣＡ２ａ表达，抑制ｍｉＲ ２５改善心功能［５］。

中药被广泛用于慢性心衰的治疗，但由于作用机制不明确和缺乏令人信服的证据等原因，限制了其进一步应用。

泻肺利水中药由东莞市中医院心内科根据中医理论及多年临床实践而研制，功能宣肺平喘、降气利水、益气活血。

临床观察显示泻肺利水中药能改善ＣＨＦ患者心功能，降低脑尿钠肽（ｂｒａｉｎｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ，ＢＮＰ），增加患者６ｍｉｎ步行距离，提高患者生活质量［６］，因此，有必要对其作用机制作进一步研究。

本实验通过腹腔注射阿霉素建立大鼠心衰模型，观察大鼠心肌ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ和ｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐ的表达水平，探讨泻肺利水方药的干预作用，为心衰治疗提供实验依据。

１材料与方法
１．１材料
实验动物：健康雄性ＳＤ大鼠５０只（２４０±１５）ｇ由广州中医药大学动物实验中心提供［动物许可证号：ＳＣＸＫ（粤）２０１３ ００２０；动物合格证号：ＮＯ．４４００５９０００］。

ＳＰＦ级净化空间，生长条件为１２ｈ／１２ｈ光照周期，温度（２２±３）℃，相对湿度（４０～７０）％，自由摄食、饮水。

药物与试剂：实验药物采用指南［７］推荐剂量，并经过人与大鼠体表面积换算，大鼠中药剂量采用换算剂量的２倍。

泻肺利水方药由葶苈子１５ｇ、杏仁１０ｇ、茯苓３０ｇ、黄芪１５ｇ、陈皮６ｇ、三菱１０ｇ和大枣２ｇ组成，中药饮片购自东莞市药材公司，由东莞市中医院制成流浸膏，并浓缩至每毫升２．２ｇ生药， ２０℃保存。

卡托普利（中美上海施贵宝，批号：ＡＡＢ９４６５）配成１．９ｍｇ／ｍｌ溶液；地高辛（上海信谊，批号：０２０１５０２０１）配成３．２μｇ／ｍｌ溶液。

阿霉素（ＭｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓＬＬＣ，批号：ＨＹ １５１４２）；氯胺酮（福建古田药业，批号：１５０４１５３）；地西泮（天津金耀药业，批号：１５０７０７７）。

超微量Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶检测试剂盒（南京建成，批号：２０１５０９）；ＲａｔＢＮＰＥＩＡ试剂盒（批号：０８２８１５７００５，ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．）。

ＲＴ ＰＣＲ试剂由ＤＢＩ公司提供。

主要仪器：ＨＰ５５００心脏超声仪，美国惠普；电子天平（ＢＳ２１０Ｓ），日本Ｓａｔｏｒｉｕｓ公司；超净工作台，苏州净化设备公司；紫外分光光度计（ＵＶ １２０６），日本ＳＨＩＭＯＤＺＵ公司；冷冻离心机（ＳＣＲ２０Ｂ），日本ＨＩ ＴＡＣＨＩ公司；低温高速离心机（Ｚ３２３Ｋ），德国ＨＥＲＭＬＥ公司；ＧＤＳ７６００凝胶扫描系统，英国ＵＶＰ公司； ２０℃、 ８０℃冰箱，海尔集团；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３０００ＰＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ仪，美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司。

１．２心衰动物模型制备
ＳＤ大鼠适应性喂养１周后，参照文献［８］通过腹腔注射阿霉素（总剂量１５ｍｇ／ｋｇ，每次２．５ｍｇ／ｋｇ，配成０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液，２周内分６次注射）建立大鼠心衰模型。

对照组腹腔注射同等剂量生理盐水。

首次腹腔注射５周后应用心脏超声仪检测并计算左室短轴缩短率（ｒａｔｅｏｆｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｈｏｒｔａｘｉｓｓｈｏｒｔｅｎ，ＦＳ），成模大鼠心腔扩大，ＦＳ＜３０％。

１．３分组和干预
ＳＤ大鼠随机分为５组：对照组、模型组、中药组、卡托普利组和地高辛组（ｎ＝１０）。

后３组分别以泻肺利水方药（２２ｇ／（ｋｇ·ｄ））、卡托普利（１９ｍｇ／（ｋｇ·ｄ））和地高辛（３２μｇ／（ｋｇ·ｄ））灌胃，对照组和模型组灌以１ｍｌ／１００ｇ蒸馏水灌胃，每天１次，连续３５ｄ。

１．４大鼠心脏功能检测
干预前后采用腹腔注射氯胺酮（５０ｍｇ／ｋｇ）和地西泮（５ｍｇ／ｋｇ）混合麻醉大鼠，胸前剃毛，仰卧位固定于木板上，应用心脏超声仪，分别测量左室舒张末期内径（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄｄｉａｓｔｏｌｉｃｄｉａｍｅｔｅｒ，ＬＶＥＤＤ）、左室收缩末期内径（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄｓｙｓｔｏｌｉｃｄｉａｍｅ ｔｅｒ，ＬＶＥＳＤ）、左室舒张末期容积（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃｖｏｌｕｍｅ，ＬＶＥＤＶ）和左室收缩末期容积（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃｖｏｌｕｍｅ，ＬＶＥＳＶ）等，计算心输出量（ｃａｒｄｉａｃｏｕｔｐｕｔ，ＣＯ）和左室射血分数（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ，ＬＶＥＦ）。

１．５ＥＬＩＳＡ法检测血浆ＢＮＰ水平
处死大鼠时腹主动脉取血，肝素抗凝，静置１ｈ，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清－２０℃冰箱保存，按试剂盒说明书进行操作。

７
４
１
中国应用生理学杂志，２０１７，３３（２）
１．６定磷法测定ＳＥＲＣＡ２ａ活性心肌组织冰水浴机械匀浆，２５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ
；酶标板加入去离子水、标准溶液和相应浓度蛋白液体；样品稀释２０倍，取２５μｌ置于酶标板中，根据样品及标准品数量，按５０∶１配制ＢＣＡ工作液；各孔加入２００μｌＢＣＡ工作液，振荡器上振荡３０ｓ，３７℃放置３０ｍｉｎ，于５７０ｎｍ处读取吸光值。

以蛋白浓度（ｍｇ／ｍｌ）为纵坐标，吸光值为横坐标，绘出标准曲线，根据所测样品的吸光值及标准曲线回归方程得
到相应的样品浓度。

超微量Ｃａ２＋ ＡＴＰ酶检测试剂
加样品混匀，３７℃水浴反应１０ｍｉｎ，３５００ｒ／ｍｉｎ
离心１０ｍｉｎ，取上清、双蒸水和０．０２μ
ｍｏｌ／ｍｌ磷标准液各１５０μｌ、定磷剂应用液５００μｌ混匀，室温静止２ｍｉｎ，加终止剂５００μｌ混匀，室温静置５ｍｉｎ，波长６３６ｎｍ，光径０．５ｃｍ，双蒸水调零，测定各管吸光值。

计算公式：
组织中ＡＴＰａｓｅ活力（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）＝测定ＯＤ值－对照ＯＤ值
标准ＯＤ值－空白ＯＤ值×标准品浓度（０．０２μ
ｍｏｌ／ｍｌ）×６×２．８÷
待测样本蛋白浓度（ｍｇｐｒｏｔ／ｍｌ）１．７ＲＴ ｑＰＣＲ检测大鼠心肌ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ和ｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐ
表达水平取心肌组织１００ｍｇ在液氮中充分研磨，加入１ｍｌＴｒｉｚｏｌ，震荡混匀室温放置５ｍｉｎ；加入０．２ｍｌ氯仿，剧烈震荡１５ｓ，静置３ｍｉｎ；４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；加入等体积异丙醇，混匀，静置２０ｍｉｎ；４℃
１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清；１ｍｌ７５％ＤＥＰＣ酒精洗涤沉淀；４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ
，弃去液体；室温晾干，３０μｌＤＥＰＣｄｄＨ２Ｏ溶解ＲＮＡ，抽样鉴定后于－８０℃冻存备用。

以１μ
ｇ总ＲＮＡ为模板，配制ＢｅｓｔａｒｑＰＣＲＲＴＫｉｔ逆转录反应体系：１μｇ总ＲＮＡ，ＰｒｉｍｅｒＭｉｘ１．０，ＤＥＰＣＨ２
Ｏ，６５℃５ｍｉｎ，冰上急冷；５ｘＲＴＢｕｆｆｅｒ４．０，ＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘ１．０，ＤＥＰＣＨ２
Ｏ４．０，总体系为２０μ
ｌ，３７℃，６０ｍｉｎ；９８℃，１０ｍｉｎ，合成ｃＤＮＡ第１链。

ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ扩增的反应体系为２０μ
ｌ（ＤＢＩＢｅｓｔａｒ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎｑＰＣＲｍａｓｔｅｒＭｉｘ）：Ｂｅｓｔａｒ Ｓｙｂｒ ＧｒｅｅｎｑＰＣＲｍａｓｔｅｒＭｉｘ１０μｌ，ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０
μｍｏｌ／Ｌ）０．５μｌ，ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５μｌ，ｃＤＮＡ模板１μｌ，ｄｄＨ２Ｏ８μｌ。

ＰＣＲ反应条件：逆转录９４℃灭活逆转录酶及预变性２ｍｉｎ，９４℃变性２０ｓ，５８℃退火２０ｓ，７２℃延伸２０ｓ，ＰＣＲ扩增４０循环。

融解曲线分析：温度６２℃～９５℃。

用ＡｇｉｌｅｎｔＳｔｒａｔａ ｇｅｎｅ荧光定量ＰＣＲ仪Ｍｘ３０００Ｐ进行荧光定量ＰＣＲ。

反应完成后计算机自动分析Ｃｔ值，采用２ ΔΔＣｔ方法计算相对比值。

ＳＥＲＣＡ２ａ和ｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐ分别以β
ａｃｔｉｎ和Ｕ６作为内参，其引物见表１。

１．８统计学处理
实验数据采用均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，采用ＳＰＳＳ２２．０
统计软件包进行统计学分析，用配对ｔ检验进行自身显著性检验，多组间比较采用单因素方差（ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ）分析，ＳＬＤ法进行组间两两比较，率的比较采用卡方检验。

２结果
２．１大鼠造模结果
对照组有９只大鼠成功采集数据。

模型组、中药组、卡托普利组和地高辛组各有８、９、８、７只大鼠成功造模。

成模大鼠出现食欲减退、精神较差、张口呼吸和乏力等症状，ＣＯ和ＬＶＥＦ无显著差异，
均明显低于对照组（Ｐ＜０．０１，表２）；其平均体重分别为３６８．９±２７．５、３７３．６±２２．７、３７１．８±２１．６和３８１．２±
２１．３（ｇ），组间无显著差异，均明显低于对照组ｇ（Ｐ＜０．０１）。

２．２心脏功能指标
干预后，模型组大鼠ＣＯ与ＬＶＥＦ明显低于对照组（Ｐ＜０．０１
），中药组、卡托普利组和地高辛组大组Ｔａｂ．１ＰｒｉｍｅｒｓｆｏｒＲＴ ＰＣＲ
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５＇→３
＇）Ｐｒｏｄｕｃｔ（ｂｐ
）ｍｉＲ ２５ ３ｐ
ＲＴｐｒｉｍｅｒＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＧＡＣＣ７２
ＦｏｒｗａｒｄＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＴＲｅｖｅｒｓｅＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡｍｉＲ ２５ ５ｐＲＴｐｒｉｍｅｒＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＡＡＴＴＧ７５
ＦｏｒｗａｒｄＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＧＣＡＡＴＴＧＲｅｖｅｒｓｅＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＵ６ＲＴｐｒｉｍｅｒＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴＣＡＴ６４
ＦｏｒｗａｒｄＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＲｅｖｅｒｓｅＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴＳＥＲＣＡ２ａＦｏｒｗａｒｄＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＡＴＣＧ１６７ＲｅｖｅｒｓｅＧＡＴＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧβ
ａｃｔｉｎＦｏｒｗａｒｄＧＧＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＡ１５０
Ｒｅｖｅｒｓｅ
ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧ
８４１ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１７，３３（２
）
ＣＯ明显高于模型组（Ｐ＜０．０１），中药组ＬＶＥＦ明显高于模型组（Ｐ＜０．０５）；中药组与卡托普利和地高辛组比较无明显差异。

干预后中药组ＣＯ和ＬＶＥＦ明显高于干预前（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），地高辛组ＬＶＥＦ明显高于干预前（Ｐ＜０．０５，表２）。

Ｔａｂ．２ＩｎｄｉｃｅｓｏｆｃａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｌａｓｍａｌｅｖｅｌｏｆＢＮＰ（珋ｘ±ｓ）
Ｇｒｏｕｐｎ
ＣＯ（ｍｌ／ｍｉｎ）
ＢｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔＡｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＬＶＥＦ（％）
ＢｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔＡｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＢＮＰ（ｐｇ／ｍｌ）
Ｃｏｎｔｒｏｌ９６７．３９±１０．４１６２．１４±１１．５２８０．７４±７．４２８７．５５±８．３９１４５．１１±１４３．０５Ｍｏｄｅｌ８４４．５９±１０．３２３９．９１±６．１３ ５０．１７±４．６６５５．５８±１０．６８ １１０５．５７±５７６．９７ ＴＣＭ９４１．７４±５．１６５９．４６±７．６８＃＃△△５４．６１±７．１８６３．３７±５．８９＃△３７０．４２±２８５．０５＃＃Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ８４８．５８±６．２６５１．５８±１３．２６＃＃６０．２８±６．９６６１．８０±５．５０３４７．５０±２９９．８２＃＃Ｄｉｇｏｘｉｎ７４７．３１±７．４６５２．５３±１０．２４＃＃４７．２７±９．４４６１．３９±６．７８△３５０．４６±２７２．８８＃＃ＣＯ：Ｃａｒｄｉａｃｏｕｔｐｕｔ；ＬＶＥＦ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ；ＢＮＰ：Ｂｒａｉｎｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ；ＴＣＭ：ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ Ｐ＜０．０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；△Ｐ＜０．０５，△△Ｐ＜０．０１ｖｓｂｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
２．３血浆ＢＮＰ水平
模型组血浆ＢＮＰ水平显著高于对照组（Ｐ＜０．０１），中药组、卡托普利组和地高辛组血浆ＢＮＰ水平显著低于模型组（Ｐ＜０．０１），中药组与卡托普利组和地高辛组比较无明显差异（表２）。

上述变化提示泻肺利水中药、卡托普利和地高辛均能降低血浆ＢＮＰ水平。

２．４心肌细胞ＳＥＲＣＡ２ａ活性
模型组心肌细胞ＳＥＲＣＡ２ａ活性显著低于对照组（Ｐ＜０．０１），中药组ＳＥＲＣＡ２ａ活性显著高于模型组、卡托普利组和地高辛组（Ｐ＜０．０５，表３）。

上述变化提示泻肺利水中药提高ＳＥＲＣＡ２ａ活性，卡托普利和地高辛作用不明显。

２．５ＲＴ ｑＰＣＲ结果
模型组ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平明显低于对照组，ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ水平明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）。

中药组、卡托普利组和地高辛组ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平明显高于模型组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。

中药组和卡托普利组ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ水平明显低于模型组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。

中药组ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平明显高于地高辛组，ｍｉＲ ２５ ５ｐ水平明显低于地高辛组（Ｐ＜０．０５）。

各组ｍｉＲ ２５ ５ｐ的表达水平均高于ｍｉＲ ２５ ３ｐ（Ｐ＜０．０１，图１，表３）。

上述变化提示泻肺利水中药和卡托普利均能提高ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平，降低ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ水平。

３讨论
兴奋 收缩耦联是心肌收缩和舒张的基础，Ｃａ２＋在心肌细胞兴奋 收缩耦联中起着关键作用。

心肌细胞兴奋，细胞膜上的电压依赖性Ｌ 型钙通道开放，细胞外少量Ｃａ２＋内流，触发肌浆网兰尼碱受体通道在短时间内释放大量的Ｃａ２＋，胞浆Ｃａ２＋
浓度瞬Ｆｉｇ．１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ，ｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐｉｎｍｙ ｏｃａｒｄｉｕｍｏｆｒａｔｓ
Ｔａｂ．３ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＲＴ ｑＰＣＲａｎｄＳＥＲＣＡ２ａａｃｔｉｖｉｔｙ（珋ｘ±ｓ）
Ｇｒｏｕｐｎ
ＳＥＲＣＡ２ａ
ｍＲＮＡ
ｍｉＲ ２５ ３ｐｍｉＲ ２５ ５ｐ
ＳＥＲＣＡ２ａａｃｔｉｖｉｔｙ
（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）
Ｃｏｎｔｒｏｌ９０．６０±０．２１０．９０±０．１５２．１４±０．８０▲▲０．１０３±０．０４８
Ｍｏｄｅｌ８０．３１±０．０８ １．４５±０．２３ ３．５６±１．３５ ▲▲０．０３２±０．０１９ ＴＣＭ９０．５６±０．２０＃＃１．１１±０．２１＃２．１６±１．２４＃＃▲▲０．０７３±０．０４６＃Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ８０．５１±０．２４△１．１４±０．３２＃２．６５±０．９３＃▲▲０．０４３±０．０２４△Ｄｉｇｏｘｉｎ７０．４４±０．１８△１．２８±０．４１２．９２±１．０６△▲▲０．０３９±０．０２２△ＳＥＲＣＡ２α：ＳａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍＡＴＰａｓｅ２α
Ｐ＜０．０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；△Ｐ＜０．０５ｖｓＴＣＭｇｒｏｕｐ；▲▲Ｐ＜０．０１ｖｓｍｉＲ ２５ ３ｐ
时大幅升高，Ｃａ２＋与肌钙蛋白结合，心肌收缩。

当心肌细胞复极化时，胞浆中的Ｃａ２＋主要由ＳＥＲＣＡ２ａ重摄入肌浆网内，部分Ｃａ２＋通过细胞膜上的钠 钙交换体转移出细胞外，胞浆Ｃａ２＋浓度下降，Ｃａ２＋与肌钙蛋白解离，心肌舒张。

心力衰竭的最基本机制是心肌细胞的兴奋 收缩耦联障碍，心肌收缩和／或舒张功能受损。

衰竭心脏ＳＥＲＣＡ２ａ的活性或含量下降使肌浆网摄取Ｃａ２＋减少，胞浆中Ｃａ２＋浓度下降速度和幅度不足，心肌舒张延缓且不够充分；肌浆网的Ｃａ２＋储存量减少，心肌收缩时释放的Ｃａ２＋减少，心肌收缩功能下降。

研究表明，ＳＥＲＣＡ２ａ具有正性肌力和正性变舒张效应，能够提高心肌收缩力和改善
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中国应用生理学杂志，２０１７，３３（２）
舒张功能，过表达ＳＥＲＣＡ２ａ可以改善心功能［４］。

ＣＵＰＩＤ研究［９］发现通过腺相关病毒将ＳＥＲＣＡ２ａ相关基因转入患者体内，可以改善重度收缩期心衰患者的症状，降低死亡率和心衰相关住院率，减少心衰加重情况，但ＣＵＰＩＤⅡｂ研究未能取得预期的临床效果［１０］。

微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）是由１８～２４个核苷酸构成的单链非编码ＲＮＡ，调节胚胎发育、组织分化、细胞增殖、凋亡、血管生成和代谢等多种生物学过程。

ｍｉＲＮＡ主要通过抑制蛋白质翻译或ｍＲＮＡ降解调控基因表达［５，１１］。

Ｗａｈｌｑｕｉｓｔ［５］指出：ｍｉＲ ２５通过作用于ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ的３’非翻译区（３’ ＵＴＲ）的靶基因ｍＲＮＡ结合位点而抑制ＳＥＲＣＡ２ａ的翻译。

本实验结果提示：衰竭心脏中ＳＥＲＣＡ２ａｍＲ ＮＡ水平降低，ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ水平升高；在ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ表达受抑制的衰竭心脏中，ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平升高，实验动物的心功能得到改善，这可能与ｍｉＲ ２５ ３ｐ和／或ｍｉＲ ２５ ５ｐ抑制ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ降解相关。

本实验中，泻肺利水方药、卡托普利和地高辛均能提高ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平；泻肺利水中药能降低ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ的表达，提高ＳＥＲＣＡ２ａ的活性，这与ＳＥＲＣＡ２ａ表达增加有关。

ｍｉＲ ２５ ３ｐ有与ｍｉＲ ２５相同的３’末端序列，也可能与ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ的３’ ＵＴＲ的结合位点结合而抑制ＳＥＲＣＡ２ａ的翻译，抑制ｍｉＲ ２５ ３ｐ可以提高ＳＥＲＣＡ２ａ的表达水平和活性。

卡托普利和地高辛不能提高ＳＥＲＣＡ２ａ的活性。

泻肺利水方药能提高ＣＯ和ＬＶＥＦ，显示其均能增加心肌收缩力、改善心功能，这些作用与ＳＥＲＣＡ２ａ的活性提高相关。

ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ均为ｍｉＲ ２５前体的产物，分别从ｍｉＲ ２５前体的５’端臂和３’端臂加工而来的。

本实验中，ｍｉＲ ２５ ３ｐ和ｍｉＲ ２５ ５ｐ的趋势是一致的，ｍｉＲ ２５ ５ｐ水平显著高于ｍｉＲ ２５ ３ｐ的具体机制尚不清楚，可能两者升高和回落有时间差，或者大量的ｍｉＲ ２５ ３ｐ作用于ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ的３’ ＵＴＲ从而导致其可检测量降低。

中医认为，慢性心衰主要表现为呼吸困难、气喘咳嗽和水肿等，辩证属水气上凌心肺，治法当“从肺论治”，泻肺利水，以恢复肺主气司呼吸、主宣发肃降、肺朝百脉主治节以通调水道之功能。

泻肺利水方中葶苈子泻肺平喘、利水消肿，黄芪补气利尿消肿，杏仁平喘，陈皮理气化痰，茯苓利水化痰宁心，三菱破血行气，大枣补中益气、养血安神兼制葶苈子毒性，全方组合共奏通肺行水之功［１２］。

本实验证明该中药能抑制ｍｉＲ ２５ ３ｐ／５ｐ表达，提高ＳＥＲＣＡ２ａ表达水平和活性，改善心功能。

本实验动物样本量少，只针对阿霉素诱导的心衰大鼠模型，泻肺利水方药治疗ＣＨＦ的分子机制有待大规模的动物实验和临床试验进一步验证。

【参考文献】
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１ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１７，３３（２）。