二参益气补肾胶囊对慢性肾衰竭大鼠肾小管间质纤维化的保护及机制研究

二参益气补肾胶囊对慢性肾衰竭大鼠肾小管
间质纤维化的保护及机制研究
张进珍①
〔摘要〕目的:探究二参益气补肾胶囊(Ershen)对慢性肾衰竭(CRF)大鼠模型肾间质小管纤维化的保护作用及其对TGF-0/P38MARK信号通路的影响。

方法：采用腺h吟灌胃制备CRF大鼠模型，将实验动物分为模型对照组(M o/X)、贝那普利组(Benazepril)(5mg•kg"1•d"1)和二参益气补肾胶囊组(Eohen)(5g•kg"1•d"1)，另设空白对照组(Noma/，给药8周，检测24h尿蛋白、血清尿素氮、肌肝等生化指标，HE染色检测肾损伤、TUNEL检测细胞凋亡、免疫组化检测TGF-0]、Westere blot检测p33MAPK。

结果：二参益气补肾胶囊组尿蛋白定量减少，血清肌肝及尿素氮较模型组减轻；二参益气补肾胶囊组肾小球数目较模型对照组增加，肾小管间质损伤程度较轻；TUNEL凋亡指数下降，其TGF-0]含量少于模型组，其肾组织p33MAPK表达受抑制。

结论:二参益气补肾胶囊改善腺h吟致大鼠肾小管间质纤维化可能与下调TGF-B]/p33MARK 表达，抑制肾小管上皮细胞凋亡有关。

〔关键词〕肾间质小管纤维化二参益气补肾胶囊转化生长因子-08p33MARK细胞凋亡
Protection and MecUanism of ErsUen Yiqi Brshen Capsule on Tubulointerstitiat
FiVrosio in Rato with Chrrniu Renat Failurr
ZHANG Jinzhee
Deeartrneat of Nephrology,SSaaxt Hospitnl of Tramtionnl Chinee Mericiae,Taiyuan(030010)
ABSTRACT Objective：To explore the effect of Enhenyiqidushen capsule ox the renal inters/tiai fidrosis rats and by active-tina TGF-01/p33MARK$1x118/11)pathway.Methods：Hea/hy rats were divided randomly inte Normal groxp,mohei groxp,Benaze­pril groxp and Ershen g roxp,10cases in each groxp,chroxic renal failure rat mohei by intrayastricly abministrated250mg/kg abenine so/tioc for 4weeds coytmuohs/.Aftes8weeds108(116X(,The serum levels of creatinine and urea nitrogen were measared by biochemical methoh,24h urine protein contents were measered,the expression of MAPK p33was detected by Western B/h the expression of TGF一0]by Immirnohistochemistra,and renal pathologicai changes were ohserved with hematoxylin一eosin staining-Resultt：After0x0116X(,Ershen groxp shows sionificantly reduced renal patho/gicai damage,and the urine protein and BUN ,Sec, TGF一01,p33MARK expression in renal tissues decreased sionificant/.Conclusion:ErshenyiqiOushen capsule can reduce the kid­ney injury in chronic renal failure rats throuuh indidiOna the TGF一01/p38MARK sionaliny pathway.
KEY WORDS Renal inters/Oai fibrosis ErshexyiqiOushen capsule TGF-01p33MARK Apoptosis
肾小管间质纤维化（RIL）是多种肾脏疾病发展到终末期肾衰竭的共同通路，还是慢性肾衰竭进行性发展过程中的始动因素,被作为衡量肾脏疾病慢性进展的重要指标之一。

采取有效的治疗策略延缓其进展成为治疗慢性肾脏病（CKD）的重点方向。

TGF-07 p38MARK是肾脏纤维化过程中重要的信号通路m2］。

大量临床实践和实验研究显示，中医药治疗RIL可以从不同的作用靶点和信号通路途径发挥作用。

二参益气补肾胶囊是山西省中医院医疗机构制剂，由冬虫夏草、西洋参、灵芝、丹参四味药组成，具有益气补肾、活血祛瘀之功效。

本文采用腺瞟吟制备类似于临床的CRF大鼠模型，观察二参益气补肾胶囊干预对模型动物肾间质小管保护以及其对TGF-07 p38MARK信号通路的影响。

材料与方法
1实验材料雄性SD大鼠44只，体重（200土29）g：北京华阜康生物科技股份有限公司；二参益气补肾胶囊：山西省中医院，批号：2616191894；盐酸贝那普利片（洛汀新）：北京诺华制药有限公司生产，扌比号:X2631；腺瞟吟（Adexide）:美国AMRESC公司；碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，南京恩晶生物科技
①山西省中医院肾病二科（太原930912）
有限公司;TGF-01抗体（美国Santa Cruz公司）;p38 MAPK、p-p38MAPK抗体（美国SCT公司）；HRP标山羊抗兔、山羊抗鼠抗体（上海碧云天生物技术有限公司）
2造模及给药大鼠随机分为4组，除空白对组外,模型组、贝组（5mg•kg-1•）-）、二益气补肾胶囊组（5g•kg"1•）_1），按255mg•kg"1•）-剂量灌胃给予2.5%腺（10mmku）,每日、次，连续灌胃4周［1］。

造模后大鼠，给药组药物蒸憎水灌胃给药,灌胃量2。

m/kg,每日、次,续8周，空白、模型组给予等量蒸憎水灌胃。

3标本采集治疗第8周行24h尿蛋白检测。

大门静脉取血并分离血清检测血清尿素氮（BUN）和肌）（Scrfo取血后的大鼠，立即剖取双肾、称重，计算肾系数（双肾重/体重），肾组4%甲醛固定，制作肾脏病理,HE、Massou 色。

4肾脏病理形态学变化肾脏组织进行脱水、埋、、,HE.Massou染色,200倍光镜,质部含肾小球的1，，显微镜下观察并，采用Imaga-Pro Plus6.9软件对像半定量分析，作为判断肾脏纤维的o
5免疫组化检测肾组织TGF-01的表达石蜡切片脱蜡水化，抗原热修复,3%H2O0灭活33mio, PBS冲洗，加抗TGF-01抗体的稀释液孵育,4C过夜,,HRP标记的二抗，显微镜下控制DAB液显色，苏复染。

大400，,先5个包含1肾小球及3个肾小管的，棕黄色着色为阳性,6，显微镜下观察并拍照，采用Imaga-Pry Plus6.9软件对图像分析。

6肾脏组织TUNEL凋亡细胞检测⑶，切片脱蜡水化，蛋白酶K浸入封（3%比。

2）,室温孵育5min；脱氧酸转移酶（TdT酶）反应液50以，随后滴加Sweptavidio-HRP 工作液10以,37C避光湿润33min后DAB工作色。

光镜5含、个肾小球及3个肾小管的高（X440）观察,细胞核或胞浆中见棕色者为凋亡细胞,6
微镜下观察并，采用Imaga-Pro Plus6.0软析数细胞数和凋亡细胞数，算凋亡指数（AI）o
7肾脏p38MAPK表达检测采用Western blut ，取10mg肾组,裂，匀浆卡
4C下12000r/mio离心20min,取上清。

BCA法测量蛋白浓度,SDS-PAGE蛋白电泳,后转至PVDF膜。

用5%脱脂奶粉封闭66mi-TBST液漂洗后，一抗p38MAPK（51000）,p-p38MAPK（1:1000）,TGF-01（1：1000）,4C孵育过夜。

二抗孵育ECL试剂显色。

同时测定0-actio（1：1000）表达作为参照,光定影。

用Imaga LaL5.1软半定量分析。

8统计学方法实验结果资料以（X±5）表示,采用SPSS17.9统计软数析。

组间比较用因差分析或者秩和检验分析;P<0.95表示差学意义。

结果
1二参益气补肾胶囊对CRF大鼠肾功能及尿蛋白的图、显示，模型对照组双肾重、肾系数显著高于空白对照组（P<0.001），贝组、二参益补肾肾重、肾系数比模型对照组有下降趋势。

同时，与空白对照组比较，模型组大鼠24h尿蛋白、BUN、Scr明显升高（<0.001、<0.901）,童模成功。

二参益气补肾胶囊组和贝那普利组显著低模型对照组（P<0.05、P<0.901）o
2.5
1
U
-2
-2J
P
O
O
-Eua!
七
須
2.0-
1.0
0.5
1.5
Normal Model Ershen Benazepril
(
J
/
s
u
e
u
-s l
o
J
d
二
80
(
T
o
u
m
)
N
n
q
Normal Model Ershen Benazepril
<0.05,忡<0.001
图1对CRF大鼠肾系数、尿蛋白、BUN、Scr
的影响
2二参益气补肾胶囊对CRF大鼠肾脏病理的影响模型组大鼠肾小球囊腔缩小，球囊黏连、硬化;大肾小管萎缩、坏死、囊状扩张，部分管腔内可见蛋白管型、细胞管型，间质纤维，大量炎症细胞浸润;二参益气补肾组、贝组肾脏病理变化较模型组减轻。

Massox染色图2显示，与空白组比较,模型组肾间质沉积,见大量域，细胞外基质增加，肾间质纤维；二参益气补肾组和贝组肾脏纤维低模型组(P<0.21)o
3二参益气补肾胶囊对肾组织TGF-0(表达的影响图3显示，各组肾组织TGF-0(表达水平空白对照组(0.12±0.02)、模型组(0.572±0.1)、二参益气补肾胶囊组(0.351±0.1)、贝组(0.567土0.21)，与空白对照组比较,组肾组织TGF-0(表达增加，差学意义(P<0.21)；与模型组比,二益补肾组贝组,肾组TGF-0(表达水平明显减低，但高于空白对照组，差 学意义(P<0.05)o
4二参益气补肾胶囊对肾小管TUNEL凋亡细胞的图4显示，空白对照组肾小管TUNEL凋亡细胞数(443±11)、AI指数(15,2±4.01)，模型组凋亡细胞数(2025±349)、AI指数(55.9±6.70),二益气补肾组凋亡细胞数(465±435)、AI指数(40.1±1.9),贝组凋亡细胞数(1353±367)、AI指数(39.9±1.6)，空白对照组肾脏组织凋亡细胞数和AI显著低于模型对照组(P<0.001),贝、二参益气补肾组凋亡细胞数和AI明显低于模型对照组(P<0.05)o
模型对照组肾小管上皮细胞核或胞浆中见棕色颗粒的凋亡细胞,空白对照组肾脏组织凋亡细胞数和AI显著低于模型对照组(P<4.241),贝、二参益气补肾组凋亡细胞数和AI明显低于模型对照组(P<4.45),表明二参益气补肾组对腺瞟吟致肾组织细胞凋亡有改善作用。

见表1
表1TUNEL凋亡检测二参益气补肾胶囊对腺瞟吟模型大鼠肾脏AI的影响(n=44,2土s)
组凋亡细胞数细胞数(AI)
空白对照组443±114***2956±44215.2±4.61***模对组2425±3493611±33455.9±6.94
贝组1353±367*3523±66139.9±13.6*
二参益气补肾胶囊1445±435*3713±66644.1±12.0*
注:与模型对照组比较,P<4.45,**P<4.41,***P<4.241
5二参益气补肾对p33MAPK蛋白表达的5和图6显示，各组肾组织p33MAPK表达水平空白对照组(4.459±4.424)、模型组(4.913土4.253)、二参益气补肾胶囊组(4.561±4.434)、贝那
组(4.587±4.461),与模型组比较，二参益气补肾组、贝组降(均P<4.41),而二参益补肾组与贝组组间差学意义(P〉4.45)o
空白模型贝那二参益气补
对照组对照组普利组肾胶囊组
p38MARK
+-Actin
图5大鼠肾脏p38MAPK蛋白的表达
8!<0.05,**!<0.001
图6大鼠肾脏p38MAPK蛋白的表达
讨论
国医学认为慢性肾属于“关格”、“水肿”、“虚劳”等范畴。

其病机为肺脾肾调,壬化司，湿浊、瘀血潴留体内。

脏腑虚衰是肾间质纤维的内在基础，正虚，虚实夹杂，终致疾病病势缠2o二参益气补肾要成分为冬
、 、o冬冬夏二令之气，感阴阳二气而生,调补阴阳为君，增强肾脏蒸
，三焦通调水道之功;性寒,益气养阴,清热
生津2阳气的作用；灵芝性温，保神益精，补虚扶正，共为臣药;丹参养血活血，祛瘀生新;全方寒热并用，补 ，共奏补脾益肾，升清降浊，逐血的作用。

药理研究：冬减少尿蛋白排泄，调节免疫，保护肾小管上皮细胞,延缓肾脏病进展⑸6；西洋参能改善肾衰竭患者贫血状态，并能清除CRF中受损的抗凋亡作用，降低血肌)和尿蛋白⑺；理诸虚百损，有抗氧化、抑制微炎症作［5］；肾血流，改善高，2细血管通透性以减少炎性2肾单位逆转⑼。

RIF是多种细胞因子介导、多通转导。

转生长因子-0.是公认的肾脏纤维的关键调控因素［1］，贯穿于RF的始终,成纤维细胞合成ECM,促进肾小管上皮细胞去为MFB,加重肾组织损伤，进而使肾减退［(］。

其中
TGF-01介导的TGF-01/p38MAPK通路在促肾纤维化中发挥着重要作用。

p37MAPK信号通路主要参与应激条件下细胞的免疫调节、炎症反应、细胞凋亡。

本研究通过腺瞟吟大鼠模型观察二参益气补肾胶囊对大鼠RIL的影响，结果发现,与空白组比较，模型组血清BUN,Sec显著升高，说明肾功能明显下降；Masson染色显示,模型组细胞外基质明显增加，肾间质纤维化程度严重,TGF-01、p38MAPK蛋白表达明显增加，说明RIL中可能是通过TGF-01/p38MAPK 通路来调控ECM沉积和炎症反应。

而与模型组比较,二参益气补肾胶囊组在一定程度上能降低BUN、Sec,且肾小球基底膜、肾小管基底膜、系膜基质蓝染量介于空白与模型对照组之间，其中TGF-01、p38 MAPK蛋白表达较模型组减少，比空白组高，说明二参益气补肾胶囊能在一定程度上下调TGF-0、p38MAPK 的高表达。

由此我们推断在RIL过程中TGF-01/p38 MAPK通路活化，加剧ECM的沉积和炎症反应。

而二参益气补肾胶囊有可能通过下调TGF-01、p38 MAPK蛋白表达，从而减少ECM的过度沉积,保护肾组织，从而减轻RIF。

细胞凋亡是RIL发生发展的又一促进因素。

肾小管上皮细胞（RTC）通过凋亡机制清除衰老、变异的细胞[0];然而，持久的疾病状态可以导致RTC的不可逆凋亡，这也是引起肾小管萎缩及RIL的机制之一。

我们在实验中看到TUNEL凋亡检测中二参益气补肾胶囊组凋亡细胞数和A【明显低于模型对照组（P< 9.05）,表明二参益气补肾胶囊组对腺瞟吟致肾组织细胞凋亡作。

综上所述，二参益气补肾胶囊可改善腺瞟吟致CRF大鼠肾损伤功能，减轻肾脏间质纤维化，延缓CRF进展的作用机制，可能是通过抑制TGF-07 p38MAPK通路活化以及抗细胞凋亡而发挥作用。

（本文图2~图4见插页1-1）
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(0):873.(收稿-11-21修回：4323-92-26)
^檱**********************************************^檱作者-编者-读者
数值修约书写要求
来稿时数据要求同一指标小数位数一致，一般按标准差的1/3确定位数，例如3.01±9.02,标准差的1/3为9.I4,标准差波动在小数点后第一位，故应取小数点后第一位，写成3.6±0.4。

又如8.61±0.27,标准差的1/3为9.09,故应取小数点后第二位，写成5.01±9.27。

过多的位数并无意义。

但是在一系列数值并列时,J、数点后的位数应一致。

例如在3.61±9.42、5.86±9.73、2.34±9.15这样一组数据中，第3组数据标准差0.15的1/3为9.05,在小数点后第二位，则这组数据均应修约到小数点后第二位，写成3.61±0.42、5.86±0.73、2.34±9.15。

本刊编辑部。