2薄层色谱分离技术

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3) 硅胶的粒度与孔径：
¾ 硅胶的分离效率与其粒度、孔径及表面积等几 何结构有关。 ¾ 原则上，粒度越小，分离效果越好。 ¾ 孔径（Å）或孔体积表示硅胶粒子孔的大小的 尺度，与传递阻滞有关； ¾ 表面积越大，表明其吸附力越大，有较强的保 留。
生药学Βιβλιοθήκη 药学4）硅胶薄层板的厚度 ¾ 普通薄层厚度为250μm, ¾ 高效薄层板为200μm， ¾ 制备薄层板厚度 0.5-2 mm
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2，羧甲基纤维素钠 CMC-Na
¾ 先将羧甲基纤维素钠调成糊状，再加足量水 搅拌均匀，并加热煮沸使尽可能溶解，放置 澄清后，取上清液代替水与吸附剂搅匀涂布 薄层。 ¾ 常用的浓度为0.2％—1.0％，浓度越高, 薄层 硬度越大，是常用的粘合剂。 ¾ 缺点为：不能耐受有腐蚀性的显色剂。
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(2)亲酯性萄聚糖凝胶 • 萄聚糖凝胶只能用于水溶性物质的分离鉴定。
但在葡聚糖分子上引入有机基团，则可使之 成为亲脂性葡聚糖凝胶，如在 G—25 凝胶上 引入羟丙基基团，与糖分子以醚键相连，使 之成为既有亲水性又有亲脂性的LH—20葡聚 糖凝胶，适用于有机物如黄酮、蒽醌、色素 等成分的分离。
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薄层色谱
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特点
薄层色谱与液相色谱法比较
HPLC TLC 在一块板上点上多个样品 同时进行分离
每次只能分析一个样品
对样品制备要求高，必须 用毕一次弃去，可直接用 样品的粗提物点样 不含可吸留在柱上的杂 质，否则柱性能受损 可用检测器种类较少 展开后可用多种手段检测
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薄层色谱与柱层析和纸层析比较
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二、粘合剂与添加剂
¾ ¾ 为使薄层牢固地附着于支持体上需加 合适的粘合剂; 为特殊的分离与检出，有时要在固定相 中加入某些添加剂. 理想的粘合剂要求亲水性好、粘结力 强，且具有化学惰性 。
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1，煅石膏
¾ 将石膏（CaSO4.2H2O） 在120－140℃ 烤2－4 小时，过200目筛，备用。 ¾ 用煅石膏作粘合剂的优点：是能使用腐蚀性的 显色剂； ¾ 缺点为：薄层的硬度不够，且不利于无机物的 分离。
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4．聚酰胺：
• 聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合 物，薄层色谱中常用的是聚己内酰胺。聚酰 胺分子内有许多酰胺基，酰胺基中的碳基与 酚类、黄酮类、酸类中的羟基或羧基形成氢 键；酰胺基中的氨基与酮类或硝基化合物形 成氢键，同时由于所分离混合物结构不同， 含羟基等活性基团的数目和位置不同，因而 形成氢键的能力不同，所以对这些化合物的 吸附能力不同而得到分离。
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1，载板的制备：
• 常用载板主要为：玻璃板，塑料板，金属铝箔 等较少应用 • 载板必须是表面光滑，平整清洁 玻板大小视实验所需而定。 一般分析用： 3×5cm； 4×20cm； 10×10cm, 制备用 ：20×20cm， 20×40cm
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2，薄板涂铺方法 （1）干法铺板 ¾ 将吸附剂直接倒在板上一端，取一适当玻棒两 端包裹上适当厚度的橡皮膏或塑料管，视薄层 厚度要求而定。 ¾ 用力移动玻璃管，（用力不可过猛或太快，也 不能中途停止，以免薄层厚薄不均）如此制成 的薄板称为软板。 ¾ 由于该板易吹散，现已比较少用，多用硬板。
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5．葡聚糖凝胶 分子筛的原理
(1) 亲水性葡聚糖凝胶 • 葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖 苷，dextran)悬浮于有机相中，加入交联剂使 葡聚糖交联聚合而成．其商品名为Sephadex， 加入交联剂量不同可制成不同交联度的凝胶． • 交联度越大，网状结构越紧密，吸水时膨胀体 积越小 ． • 用于薄层色谱的凝胶粒度要细，小于40um,交 联度要低，G－50以下．
¾R
i,s
= R
f(i)
/ R
f(s)
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三、TLC的应用特点：
¾ TLC适合于样品快速定性检测 ¾ TLC除了用于分离外，更主要的是通过与已知结构化 合物相比较，来鉴定少量有机混合物的组成。此外, 经常利用 TLC寻找柱色谱的最佳分离条件。 ¾ TLC也适合于小量样品的制备，也可用于较大量样品 的纯化。如果将薄层加宽加厚，把样品点成一条线， 能分离几百毫克样品。尤其是对于Rf值相近的物质的 分离。 常用的两种制备型薄层色谱包括： ¾ 传统的制备薄层法（PTLC），即流动相借毛细作用流 经固定相。 ¾ 借外力强制性的使流动相流经固定相，如离心薄层和 加压薄层。
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甘草胶束薄层指纹图像
1
2
3
4
5
6
未经衍生的甘草胶束荧光图像（UV366nm） 1，2：光果甘草；3，4：胀果甘草；5，6：乌拉尔甘草
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没药的薄层
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一、TLC的分离原理
分离原理随所用固定相不同而不同，可分为: (l) 吸附薄层色谱 采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层，利 用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差别达到分离的目的。 (2) 分配薄层色谱 由硅胶、聚酰胺和纤维素铺成薄层，不同 组分在指定的两相中有不同的分配系数。 (3) 离子交换薄层色谱 由含有交换活性基团的纤维素铺成薄 层。 (4) 分子排阻薄层色谱 也称凝胶薄层。利用样品中分子大小 不同、受阻情况不同加以分离。 (5) 亲和薄层色谱 利用酶、受体、抗原抗体特异性识别作用。
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2．氧化铝：在薄层中其应用仅次于硅胶。由 氢氧化铝400－500℃煅烧而成。广泛的用于 萜类，生物碱，脂肪类，芳香类化合物的分 离。因制法和处理方法不同可分为碱性，酸 性，中性三类.
⑴ 碱性氧化铝：pH 9－10适于中性、碱性化合物 的分离 ⑵ 酸性氧化铝：pH 4－5适于酸性化合物的分离 ⑶ 中性氧化铝：pH 7－7.5适于酸性或对碱不稳定 的化合物的分离
(1)快速(数十秒~数十分钟) (2)分离效率高 (3)灵敏度高
(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍)
(4)显色方法多样(腐蚀性显色剂) (5)图象易保存
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薄层色谱分离技术
第一节 第二节 第三节 第四节 薄层色谱概论 制备薄层色谱 离心薄层色谱 制备型加压薄层色谱
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第一节 薄层色谱概论
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（2）湿法铺板：
¾ 一般都要加黏合剂，故称粘合薄层板（硬板）。 ¾ 常用两种硬板为：硅胶+G、硅胶 +CMC-Na ¾ 硅胶G板铺制：G的含量为10－13％，制板时每份 硅胶G + 水2－3份，研成糊状，倒在板上铺布。 ¾ 硅胶CMC-Na板铺制: 硅胶H或硅胶G + CMC-Na水 溶液（0.5％）（1：3），研成糊状，倒入板上 铺布。
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三、薄层板的制备
¾ 当前国外商品化的各种预制板均有市售，可满足各 种需要。（除个别特殊需要人工制板外） ¾ 预制板使用方便,涂布均匀,薄层光滑及有很好的牢 度.预制板有玻璃板、塑料板或铝箔板，后两种还有 剪裁方便之优点。 ¾ 国外市售预制板较多，包括普通薄层预制板（硅胶、 氧化铝、纤维素、硅藻土、聚酰胺、离子交换纤维 素、键合硅胶反相板）；高效薄层预制板（键合硅 胶预制板、手性预制板）等，规格众多，尺寸不 同，分离效果及重现性均较手工制板好。 ¾ 国内预制板规格类型较少，进口又贵，所以主要靠 自己手工制作。
薄层色谱 (Thin-Layer Chromatography TLC) • 是快速分离、定性和定量分析的一种非常重要 的色谱技术。 • 它是将固定相涂布于玻璃，铝铂，塑料片等载 板上形成一均一薄层。将被分离的物质点加在 薄层的一端，置展开室中，选用适当的展开 剂，借毛细作用从薄层点样的一端展开到另一 端，使性质不同的物质得以分离。
3，淀粉 • 将淀粉配成5%的溶液,在85℃加热至有粘性,加 入适量吸附剂制成薄层. 缺点为不能耐受有腐 蚀性的显色剂。 4，预制板粘合剂 • 商品市售预制板粘合剂有：聚乙烯醇，聚丙烯 醇，聚丙烯酰胺。 上述三种粘合剂均于实验室 自制TLC时使用． 5. 添加剂 荧光剂; 酸、碱或pH缓冲液等。
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二、TLC 的技术参数
溶剂前沿
1. 比移值: 一个化合物在 薄层板上上升的高度 与展开剂上升的高度 的比值称为该化合物 的比移值（Rf 值）。 是薄层色谱的基本定 性参数。
b
色斑中心
a
点样原点
原点到色斑中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离 =
a b
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2．相对比移值 (R i，s) ¾ 相对比移值就是被分离 物质(s)和参比物(i)的 Rf 值之比，或是被分离 物质(s)和参比物（i) 在薄层上移动距离之比.
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第二节 薄层色谱制备方法
一、固定相及载体 二，粘合剂与添加剂 三、薄层板的制备 四，上样 五、展开剂选择 六、薄层展开 七、检测方法
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一、固定相及载体
1．固定相：薄层色谱必须将被分离物质点于固定 相上进行分离，固定相要根据被分离化合物的性 质来选择。 ¾ 分离亲脂性化合物常常选用硅胶，氧化铝，乙酰 纤维素及聚酰胺。 ¾ 分离亲水性化合物常常选用纤维素，硅藻土及聚 酰胺。 但也有例外，脂溶性叶绿素在氧化铝及 纤维素上均能得到较好的分离。 2．载体：玻璃板，铝箔，塑料片等（吸附薄 层）； 纤维素，硅藻土（分配薄层）
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２） 改性硅胶：借化学反应，将有机分子键合在硅 羟基上，故称化学键合固定相。可分为极性键合 相和非极性键合相。 ① 极性键合硅胶：含极性基团（如氰基，氨基， 二醇基），与普通硅胶相比活性低。一般作正相 色谱，用非极性或极性溶剂为展开剂 ② 非极性键合硅胶：键合相表面为极性极小的烃 基如18烷基，乙基，辛基等。最常用的是18烷基 键合硅胶。用极性较大溶剂为展开剂或无机溶剂 为展开剂。因为Rf与正相色谱相反，故称反相薄 层色谱法。
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0.5％CMC-Na配制：
¾ 取适量CMC-Na + 蒸馏水加热煮沸，完全融 解，放冷静置。铺板时取其上清液使用。 ¾ 铺板时为了防止由于搅拌而带入气泡，常常加 入少量乙醇或丙酮或将吸附剂糊首先置于真空 干燥器中减压脱气，以免薄层表面出现气泡， 影响分离效果。
氧化铝因其含水量活性可分为五级。制备型 薄层用氧化铝选用2－3级
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市售氧化铝：
Ａ．含10％G ，pH 7.5－8； Ｂ．不带粘合剂的氧化铝 pH=9,也可加入波长 254nm的荧光指示剂。
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3．纤维素 • 与纸层析相似，按分配的原理 。纤维素分子是由大量纤
维二糖通过糖苷键连接的，由于有许多的 OH基，所以具 有亲水性。一分子水与与纤维素的两个羟基结合，形成 “纤维素－H2O”络合物。这种固定相可以视为一种多糖浓 溶液，即使使用与水相混溶的溶剂时，仍然形成类似不相 混溶的两相。
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（1）．硅胶：是最常用的薄层固定相，90％以上分离鉴定等 工作使用。 １） 普通型硅胶：无定型多孔粉末，表面带有硅醇基，呈 弱酸性。因为有一羟基(silanol Si-OH)，呈弱酸性（pH = 4.5）, 通过硅原子上的羟基与极性化合物或不饱和化合 物形成氢键， 所以表现为吸附性能。硅胶吸附水分形成水 合硅醇基，降低吸附能力。通常在150℃活化后失水提高 活度，此时约有4-6个硅醇基/nm2。（温度大于500℃，硅 胶脱水形成硅醚（Si-O-Si）,而失去吸附能力）。 — 活性硅胶适合分离酸性或中性化合物，如酚类，醛类， 生物碱类，甾体及氨基酸类，是基于吸附作用； — 非活性硅胶含有一定量的水分，在分离色素等时，是基 于分配作用。
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6. 离子交换剂 ¾ 葡聚糖凝胶离子交换剂
¾ 在 G-25或G-50葡聚糖凝胶上引入羧甲基、 磺乙基、磺丙基、二乙基氨乙基及季铵乙基 等而制成的既具凝胶的优点又具离子交换性 质的载体，在生化及天然化合物方面得到广 泛应用。
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7．硅藻土 • 硅 藻 土 商 品 名 celite， 是 高 度 多 孔 的，比表面积大的固体，本身具极弱的 吸附力，常作为分配色谱用的载体；或 以一定比例加入硅胶等吸附剂中可以降 低硅胶的吸附力，而有利于某些化合物 的分离。
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5）市售硅胶及预制板规格（符号及含义）
¾ 硅胶G: 是含有13％煅石膏（gypsum）黏合剂的硅胶 ¾ 硅胶H：不含黏合剂的硅胶 ¾ 硅胶 HF254：不含黏合剂，含有一种无机荧光剂（如锰 激活的硅酸锌），在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色 荧光 ¾ 硅胶 GF254：含有煅石膏黏合剂，含荧光剂，在 254nm 波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光 ¾ 硅胶HF254+366：不含粘合剂，在254与366nm波长有荧 光 ¾ 硅胶 PF254：制备型的，在 254nm 有荧光（有荧光剂， 适用于不发光不易显色物质的制备与分离）